猪博卡病毒的研究进展

郝 飞，汤德元*，罗险峰，李春燕，曾智勇，甘振磊，王 凤, 刘 建

（1.贵州大学动物科学学院，贵阳 550025；2.贵州省动物疫病预防控制中心，贵阳 550008)）

猪博卡病毒(Porcine Bocavirus,PBoV )是一种新型的细小病毒，属于细小病毒科细小病毒亚科博卡病毒属。猪感染该病毒后主要症状为腹泻，并集中在产房哺乳仔猪，哺乳仔猪死亡率达70%以上，抗生素治疗和腹泻性疫苗免疫均不能获得效果。目前博卡病毒属成员有牛细小病毒、人博卡病毒（1～4型）、犬微小病毒、猪博卡病毒、大猩猩博卡病毒以及黑猩猩博卡病毒。2009年瑞典科学家首次发现第1例猪博卡病毒（PBo-Like virus），此后在中国境内上海市、浙江省、湖北省、江苏省以及贵州省等地相继发现并分离到猪博卡病毒。

1 病毒的发现

2009年，瑞典研究人员Blomström等采集病死猪的淋巴结进行研磨，经一系列处理后提取DNA，采用随机多重置换扩增法（MDA）和高通量测序技术进行DNA扩增，最终将获得的所有片段进行克隆、测序，进行生物信息学分析，拼接出一条1879 bp的新型细小病毒片段，经序列比对后发现扩增出的片段与人博卡病毒较为相似，且其主要是NP蛋白和部分VP1蛋白的编码序列，故暂将其命名为猪类博卡病毒（PBo-Like Virus, PBoLV）[1]。随后翟少伦等[2]参照Blomström等人获得的猪类博卡病毒的序列设计引物，于2010年首次在中国检测出了猪博卡病毒。研究表明[3]，猪博卡病毒流行确实存在，并且全基因组相近于博卡病毒属，故将其划为细小病毒科、细小病毒亚科、博卡病毒属。

2 病毒的分子特征

PBoV是一种单链无包膜的DNA病毒，体积小，结构简单，为正20面体颗粒，直径约为25～30 nm。基因组为单链线性DNA，大小约为4786～5905 bp。各类型猪博卡病毒的基因组结构基本一致，基因组编码3个开放阅读框（ORF），ORF1（5’末端）编码非结构蛋白NS1，有4个亚基因组，并存在着与病毒滚环复制、解螺旋酶以及三磷酸腺苷酶活性相关的保守序列；ORF2（3’端）编码结构蛋白VP1/VP2，有2个亚基因组，VP1编码的序列内存在与病毒感染性相关的磷脂酸A2序列（与Ca2+结合环及催化残基相关序列相连）[4]；ORF3（中间序列）编码非结构蛋白NP，其主要功能还不明确。VP1/VP2是PBoV的主要抗原基因。但Cheung等[5]研究发现PPV4的序列为环状结构，长度约5905 bp。

当前国际上对猪博卡病毒尚无统一的分类，笔者参考GenBank上登录的猪博卡病毒全序列暂将其为以下几个基因型：猪类博卡病毒（PBo-Like Virus, PBoLV）基因组大小4786 bp（GenBank Number:HQ223038）；猪博卡病毒1型（(Porcine Bocavirus Type 1, PBoV1）基因组大小5267 bp（GenBank Number:HQ291308）；猪博卡病毒2型（(Porcine Bocavirus Type 2, PBoV2）基因组大小5186 bp（GenBank Number:HM053694）；猪博卡病毒3型（(Porcine Bocavirus Type 3, PBoV3）基因组大小4710 bp（GenBank Number:JF713714）；猪博卡病毒4型（(Porcine Bocavirus Type 4, PBoV4）基因组大小4125 bp（GenBank Number:JF512473）；猪博卡病毒5型（(Porcine Bocavirus Type 5, PBoV5）基因组大小5076 bp（GenBank Number:JN831651）；猪细小病毒4型（Porcine Parvovirus Type4, PPV4）基因组大小5400 bp（GenBank Number:HEN0922-5400）。

3 流行病学

猪是已知猪博卡病毒唯一的易感动物。病猪和带毒猪是其主要传染源，不同年龄、性别的家猪和野猪均可感染。自2009年首例PBoV在瑞典被发现以来，目前PBoV还只在瑞典、北爱尔兰、美国和中国的家猪被检测并分离。此外，在罗马尼亚和乌干达的野猪体内也检测到了该病毒[6-7]。2009年翟少伦等检测了来自浙江、江西、安徽、河北、河南、江苏、北京、上海、新疆9省市自治区的送检病料，PBoV的检出率在12.5%～ 88.9%之间，并且在健康的猪样品中也检测到PBoV的存在，检出率为7.3%（3/41）。2010年Shan等[8]在来自上海、江苏、安徽、山东以及贵州的共计340份健康猪病料中检测到PBoV，其阳性率为45%～75%。表明贵州省存在猪博卡病毒的流行。2010年Cheng等共检测了397份临床病料，检出PBoV的阳性率为12.59%。黄律等[9]检测了2006－2010年间来自安徽、福建、广西、河南、河北、湖北、江苏、江西、山东、上海、浙江以及新疆的705份样品（包括发病猪样品573份，健康猪样品132份），发病猪样品中PPV4检出率（2.09%，12/573）显著高于健康猪样品（0.76%，1/132）。这些研究表明目前我国猪博卡病毒的检出率非常高。

4 临床症状

猪博卡病毒可引起猪呼吸道与肠道感染，使之出现支气管炎、肺炎以及急性或慢性胃肠炎症状，引发流产、死胎，甚至死亡。哺乳仔猪多在出生 2～3 d后出现剧烈的腹泻，排淡绿色、黄绿色或灰白色水样粪便，部分仔猪有呕吐症状，病猪迅速脱水消瘦，精神沉郁、被毛粗乱，少食或不食，多数于 5～7 d内死亡，10 日龄以内的仔猪死亡率高达 50%～80%，随日龄的增加死亡率降低。病死猪消瘦、脱水、胃黏膜充血，有时有出血点，小肠黏膜充血肠壁变薄无弹性，内含水样稀便，肠系膜淋巴结肿胀。此外，猪博卡病毒对发生猪圆环病毒病与腹泻性疫病的猪只具有促进与加重病情的作用[10]。

5 诊断方法

5.1 间接免疫荧光技术（IFA）

首先将待检细胞用未标记的抗体处理，使之与特异的抗原形成复合物，然后再用抗抗体的荧光标记抗体着色，可检测出特异抗原在细胞中的存在部位，并具有荧光增强效应。McKillen等[11]在建立PBoV原代细胞培养系统时，为了鉴定猪博卡病毒在细胞上的生长情况，构建了间接免疫荧光方法，并在猪原代肾细胞的细胞核发现了绿色荧光集结。

5.2 血清学诊断方法

李彬等[12]对PBoV1的NP1基因进行克隆与表达载体构建，通过表达后，其表达产物的分子质量为46 ku，通过Western Blot，结果显示表达的NP1蛋白能与His抗体发生特异性的免疫反应，表明原核表达的NP1蛋白具有良好的反应原性，可作为诊断抗原的候选蛋白。为猪博卡病毒的血清学诊断方法奠定了理论基础。黄律[13]首次对PPV4的各个ORF框进行真核表达，研究发现只有PPV4的NS所表达的蛋白能够和PPV4阳性血清反应，对NS蛋白进行原核表达得到的蛋白要远小于NS实际编码蛋白的大小，仅约26 ku。最终纯化获得的PPV4 NS蛋白可用于监测临床血清中的抗体水平。

5.3 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应（PCR）技术[14]因其较好的敏感性、特异性和重复性，常被用来诊断病毒的DNA。博卡病毒的型内基因组序列相对保守，非常便于PCR引物设计，PBoV目前主要采用NP、NS1片段设计引物进行PCR检测。翟少伦等[15]首次建立了PBoV的PCR诊断方法，该法特异性强，敏感度高且重复性好。在对191份临床样品检测时，阳性率达39.3%（75/191），敏感性达32.2 ng/μL。该PCR方法的建立为猪博卡病毒分子流行病学的研究提供了快捷有效的检测方法（普通PCR仪即可操作）。此外，还可有效防止PBoV在我国的全面流行，尤其是在跨区引种时具有重要的作用。胡军勇等[16]建立的PCR诊断方法，具有良好的稳定性、特异性、敏感性，在对248份病料样品检测时，阳性率达69.35%（172/248）。该方法对PBoV的最低检测量为213.6拷贝，为临床诊断和流行病学调查提供了有力的支持。

5.4 实时聚合酶链式反应

实时聚合酶链式反应（RT-PCR）省去了普通PCR的凝胶成像步骤，大大缩短了病毒的检测时间。Li等[17]建立了PBoV1的RT-PCR诊断方法，在对258份临床样品进行检测时，阳性率达44.2%（114/258），敏感性达20个质粒拷贝，特异性与重复性均较好。黄律等[18]建立了PPV4的Taq Man荧光定量PCR诊断方法，该法快速敏感且特异性高，在6.73×109copies/μL～6.73×101copies/μL范围内线性关系良好，相关系数为0.998；对PPV4的最低检测限为6.73×101copies/μL。该方法的建立不仅可用于临床病料的检测，还为PBoV的体外敏感细胞的筛选以及病毒器官嗜性的研究提供了快捷敏感的分子检测技术，大大促进了PBoV分子流行病学的发展，为今后PBoV的深入研究奠定了技术基础。

5.5 环介导等温核酸扩增技术

环介导等温核酸扩增技术（LAMP）是一种新型的核酸扩增技术，依赖4条特异设计的引物和一条具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可高效、高特异性地扩增靶序列。近年来该法被广泛应用于病原体的检测。江苏省农科院的李彬等发明了猪博卡病毒的LAMP检测试剂盒及其检测方法，最低可检测到10个拷贝。其LAMP检测试剂盒不需要先进的仪器，避免了现有猪博卡病毒检测手段存在的问题，并且具有特异性强、敏感度高、检测周期短、操作简便以及易于推广等优点。该方法的有效建立，丰富了猪博卡病毒的分子流行病学研究的方法，且大大缩短了猪博卡病毒的检测时间，进一步减少了实验过程中的污染机会（只需一步即可完成实验），为大规模的猪博卡病毒检测调查提供了有效的方法。

6 防治方法

6.1 对症治疗

猪博卡病毒可导致哺乳仔猪严重腹泻甚至脱水死亡，对于发病猪需进行补液治疗，方法如下：口服法，按饮水加成品的口服补液盐 30 g/kg 和适当抗生素（如庆大霉素等）灌服（2次/d）；腹腔注射法，根据猪只大小采用 5%葡萄糖生理盐水 200 ～300 mL、5% 碳酸氢钠注射液 30 ～50 mL，腹腔注射（1 次/d）连续注射 2 ～4 d。相关研究表明，以鸡新城疫Ⅰ系疫苗为干扰源注射，可明显减轻相关病毒性腹泻症状。1 瓶鸡新城疫疫苗( 按 500 羽/份计) 可注射 15 日龄以内的仔猪 10 头，可注射 15 日龄以上仔猪（10 kg左右） 5 头。此外，发病猪场在仔猪出生 1 ～2 d 内，分别肌注长效头孢噻夫晶体注射液 0.2 mL/头，肌注右旋糖苷铁 1 ～ 2 mL/头，可增强仔猪抵抗力，明显降低猪只死亡率。

6.2 母猪返饲

目前市场上尚无商品化的猪博卡病毒疫苗，规模化猪场及散养户需做好猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征、猪细小病毒病、猪喘气病、猪传染性胸膜肺炎、猪传染性胃肠炎及流行性腹泻等其他疫病的综合防治。因此，需提前对母猪进行返饲以预防该类疫病，该法效果良好，但应尽量提早。所谓返饲，即采集仔猪粪便或病猪的肠内容物，研磨后加水浸泡 30 min，加入适量抗生素类药物（如阿莫西林），经多次过滤后与饲料搅拌均匀，对产前 6 周以内的母猪进行饲喂，每天1次，连续饲喂3 ～ 4 d，间隔 3 周后再重复饲喂一个阶段。采集腹泻粪便时需要注意保持新鲜无腐败无污染，返饲母猪饲料中需适当加入药物进行保健。

6.3 加强饲养管理

精心引种，注意不从疫区引种，坚持自繁自养，最好建立无特定病原体猪群，以免病原体传入和扩散，同时还得实行早期隔离断奶。对发病猪进行隔离治疗，最好淘汰，对病死猪进行科学处理，搞好畜舍卫生，定期消毒。因博卡病毒对碘制剂较为敏感，猪场可使用碘制剂类等加强消毒，并在栏舍和潮湿处撒生石灰，进行干燥消毒。同时还要注意母猪防暑降温、仔猪保温、畜舍通风干燥。

综上所述，猪博卡病毒作为一种新型的病毒，其许多特性都不同于传统的细小病毒科病毒，目前人们对该病毒的研究还只停留在初级阶段。对猪博卡病毒的防控不仅仅是要控制它的发生，还必须与遗传、营养、环境和气候以及饲养管理等学科相配合，从不同角度开展研究，进而控制猪博卡病毒的发生和发展，确保规模化猪场的生产安全。

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