犬细小病毒病诊断技术国家标准

犬细小病毒病诊断技术国家标准

1 范围

本标准规定了犬细小病毒病的临床检查、血凝与血凝抑制试验、PCR检测的操作方法。

本标准适用于犬细小病毒病的鉴定及其流行学调查、诊断和监测。其中病毒分离、血凝与血凝抑制试验、PCR检测适用于犬细小病毒的病原诊断。

2 试剂和材料

2.1 FK81细胞（猫肾细胞）。

2.2 0.9%生理盐水。

2.3 1%猪红细胞液。

2.4 犬细小病毒阳性血清。

2.5 96孔“v”形微量反应板。

2.6 Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5U/μL，-20℃保存。

2.7 1.5mL Eppendorf管。

2.8 0.2mL PCR薄壁管。

2.9 dNTP: 含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L，-20℃保存。

2.10 引物：浓度为20μmol/L，其序列如下：

上游引物（CPVF）：5’GAA TCT GCT ACT CAG CCA CCA AC3’；

下游引物（CPVR）：5’GTG CAC TAT AAC CAA CCT CAG C3’。

2.11 10%十二烷基硫酸钠：配制参见附录A。

2.12 蛋白酶K贮备液。

2.13 5×TBE电泳缓冲液。

3 器材和设备

3.1 PCR仪。

3.2 高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000g以上。

3.3 水平电泳仪。

3.4 凝胶成像系统。

4 临床检查

4.1 临床特征

4.1.1 潜伏期1周到2周，病初无任何症状，食欲减退或废绝，体温40℃以上，粉红色黏稠血样物。

4.1.2 病犬先出现呕吐，呕吐出白色泡沫或黄色液体，继而腹泻，粪便稀薄而恶臭，剧烈的腹泻呈喷射状，粪便呈红色，混有大量黏液或假膜。后期排番茄汁样稀便，并有特殊的腥臭味。

4.1.3 患犬迅速消瘦，倦卧不起，目光呆滞，眼窝下陷，腹围紧缩，机体脱水，皮肤干燥、弹性降低。

4.2 病理变化

4.2.1 心脏肿大呈灰黄色，切面外翻，质地松软，心肌有出血性斑纹。

4.2.2 肝脏肿大，包膜紧张，多呈黄褐色，质地松软有局灶性坏死，断面有豆蔻状花纹。

4.2.3 胃空虚，黏膜轻度潮红，附有大量黏液；小肠壁增厚，肠管变粗，肠腔狭窄，形成厚层黏膜皱褶，易于剥落，肠腔内充满紫红色粥样内容物并混有血凝块。

4.3 判定

若临床症状符合4.1.1或4.1.2且出现4.2.1或4.2.3的病理变化，则可判定疑似犬细小病毒病，其他临床症状和病理变化可作为参考指标；疑似病例可采用血凝与血凝抑制试验或PCR检测进行确诊。

5 血凝与血凝抑制试验

5.1 血凝试验（HA）的操作方法

5.1.1 样品采集活犬的泪液、鼻液、粪便，病死犬的肝、脾、肺等组织器官。将待检组织或粪便样品加等体积生理盐水研磨匀浆，3000g离心15min，收集上清液待检；口腔拭子、粪拭子用少量生理盐水浸润后，取上清液待检。

5.1.2 在96孔“v”形微量反应板上进行，自左至右各孔加50μL理盐水。

5.1.3 于左侧第1孔加50μL待检样品混合均后，吸50μL至第2孔，混合均匀后，吸50μL至第3孔，依次倍比稀释，至第11孔，吸弃50μL，稀释后病毒稀释度为第1孔1∶2，第2孔1∶4，第3孔1∶8……最后12孔为对照。

5.1.4 由左至右依次向各孔加1%猪红细胞悬液50μL置微型混合器上振荡，使血球与病毒充分混合，在37℃温箱中作用15min~30min后，待对照红细胞已沉淀可观察结果。

5.1.5 判定结果：以100%凝集（血球呈颗粒性伞状凝集沉于孔底）的病毒最大长稀释孔为该病毒血凝价，即一个凝集单位，不凝集者红细胞沉于孔底呈点状。

5.2 血凝抑制试验（HI）的操作方法

5.2.1 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配成4个血凝单位病毒溶液。

5.2.2 在96“v”形微量板上进行，用固定病毒稀释血清法，自第1孔至第10孔各加50μL生理盐水，11和12孔分别为4单位CPV细胞病毒培养液和抗犬细小病毒阳性血清对照。

5.2.3 第1孔加犬细小病毒阳性血清50μL，混合均匀，吸50μL至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50μL，如此稀释后血清浓度为第1孔1：2，第2孔1：4，第3孔1：8……

5.2.4 由第1孔至11孔各加50μL，4单位待测病毒液，第12孔50μL血清，混合均匀，置37℃温箱再作用15min~30min，待4单位病毒已凝集红细胞可观察结果。

5.2.5 判定结果：被已知犬细小病毒阳性血清抑制血凝者，该病毒为犬细小病毒。

6 PCR检测

6.1 病料的采集及处理

采集的样品包括犬的泪液、鼻液、唾液、粪便及病死犬的肝、脾、肺等组织器官。将待检组织或粪便样品加等体积生理盐水研磨匀浆，3000g离心15min，收集上清液待检。口腔拭子、粪拭子用少量生理盐水浸润后，取上清液待检。经细胞病原分离培养的样品，收集细胞沉淀待检。CPV阳性对照样品和阴性对照样品的同样处理。

6.2 DNA抽提

取上清液465μL，加入25μL 10%十二烷基硫酸钠和10μL的20mg/mL蛋白酶K，50℃水浴摇床上放置2h；加入等量的饱和酚溶液500μL，振荡混匀20s，12000g离心5min，取上清液；加入等量的酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）， 振 荡混匀 20s，12000g离心5min，取上清液；再加入等量的三氯甲烷：异戊醇（24：1），振荡混匀20s，12000g离心5min，取上清液；最后加入两倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，12000g离心10min，弃上清，室温干燥后，加入50μL双蒸水溶解沉淀，即得DNA模板，-20℃贮存备用。CPV阳性对照样品和阴性对照样品与待检样品同步进行样品处理，并进行DNA抽提。另外，DNA抽提也可采用市售的商品化DNA抽提试剂盒进行。

6.3 PCR检测

在0.2mLPCR薄壁管中，按每个样品10倍Taq酶浓缩缓冲液2.5μL、dNTP0.5μL、Taq 酶 0.5μL、DNA模板2μL、上游引物和下游引物（CPVE、CPVR）各 0.5μL、三蒸水18.5μL，配制PCR检测体系。将PCR管置PCR仪上按如下程序扩增：首先94℃变性2min；再94℃、30s，55℃、30s，72℃、40s进行35个循环；最后72℃、3min。用TBE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖平板（含 0.5μg/mLEB），将平板放入水平电泳仪，使电泳缓冲液刚好没过胶面，将10μLPCR产物和2μL加样缓冲液（6X），混匀后加入样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照。5V/cm电泳约30min，当溴酚蓝到达底部时停止，用凝胶成像系统观察结果。

6.4 结果判定

6.4.1 经PCR检测，CPV阳性对照样品可扩增出大小为609bp的核酸片段，且阴性对照样品无扩增条带，否则试验结果视为无效。

6.4.2 在符合6.4.1的条件下，若待检样品扩增出了大小为609bp的核酸片段，则初步判定犬细小病毒核酸阳性；若待检样品无扩增条带或扩增条带大小不为609bp，则判定犬细小病毒核酸阴性。

6.4.3 待检样品扩增出的阳性基因片段应进行核酸序列测定，若其序列与提供的比对序列的同源性大于等于90%，则可确诊为犬细小病毒核酸阳性，否则判定犬细小病毒核酸阴性。

6.4.4 若犬细小病毒核酸阳性且病原分离也呈阳性，则可判定犬细小病毒感染阳性。