外周血游离DNA甲基化检测:食管鳞癌早期诊疗的新机遇

李宗泰，张 灏

外周血游离DNA甲基化检测:食管鳞癌早期诊疗的新机遇

李宗泰，张 灏

癌组织DNA甲基化作为一种典型的至关重要的表观遗传事件，已被证实在食管鳞状细胞癌的发生、发展中起重要作用。近年关于食管鳞状细胞癌患者外周血与配对癌组织进行的DNA甲基化研究已初步证明两者有较好的一致性，且相比较手术或活检获得的肿瘤组织检测，外周血游离DNA甲基化检测有着无创以及可随时重复取材的优势，有望成为食管鳞状细胞癌早期筛查诊断及治疗后动态预警复发、转移的有力手段。另外，研究显示外周血游离DNA甲基化是一类可预测肿瘤治疗敏感性的潜在标志物，为滞后的食管鳞状细胞癌个体化治疗提供新思路。

食管鳞状细胞癌;外周血;脱氧核糖核酸甲基化

食管癌是全球肿瘤致死的第六大病因，其总的5年生存率不足17%;而中国食管癌的发病率和病死率均居世界之首，其中90%是食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)［1-2］。由于早期非特异症状常被忽视，大部分ESCC患者确诊时已是中晚期，往往难以通过组织标本进行早期诊断。与中晚期食管鳞癌不同，早期食管鳞癌5年生存率＞90%［3］。现行临床ESCC诊断方法如X线食管钡餐造影等，不但很可能遗漏早期病变或小病灶，而且不便于大范围筛查，预后判断和随诊复查亦缺乏理想的特异性方法。另外，目前临床ESCC个体化治疗相对滞后，尚无方便、可靠用于监测治疗反应的分子标志物。

研究发现许多肿瘤患者外周血游离DNA(又称循环DNA或无细胞DNA，包括血浆DNA或血清DNA等)与正常人相比有巨大差异，且其比外周血中蛋白质、RNA相对更稳定。而且，抑癌基因的DNA甲基化是ESCC的重要癌变机制。近年有关外周血DNA甲基化在ESCC早期筛查诊断和及早预警、干预ESCC复发转移的研究取得较多进展，其方便、快捷、特异、无创或微创的优点和巨大潜在临床价值格外引人关注。本文结合临床实际和相关文献，对其作一综述。

1 外周血游离DNA甲基化在ESCC中的生物学意义

多年前已有研究表明肿瘤患者血清DNA含量明显高于正常人［2］。Stroun等［4］首先发现循环血液中游离DNA的主要来源之一是肿瘤细胞DNA，其具有某些与原发肿瘤细胞相同的分子生物学特性。后来的研究支持了Stroun的观点，外周血游离DNA可检测到与肿瘤细胞相关的基因突变，且该变异与原发肿瘤基本一致［5］。他们均提示外周血游离DNA甲基化与肿瘤性质有良好的相关性，可充当潜在的实时肿瘤标本。

肿瘤基因表达改变主要通过两大机制:遗传学机制和表观遗传学机制。在多种肿瘤组织中的研究已提示，作为表观遗传学主要形式之一的DNA富CpG岛的启动子过甲基化不但是癌变过程中的常见早期事件，而且他与病灶发展有关。在组织或细胞标本中也证实DNA甲基化可能参与ESCC的发生、发展［6-7］，有助于早期筛查、诊断［8-9］，并且与ESCC的淋巴转移、复发有关［10-11］。而另一些研究提示外周血游离DNA甲基化与肿瘤组织DNA甲基化改变具有较高的一致性［12-13］。

2 外周血游离DNA高甲基化与ESCC

近年研究通过分析ESCC患者外周血游离DNA以及配对组织DNA中多种抑癌基因启动子的甲基化状态，发现外周血游离DNA高甲基化是ESCC特异性的早诊、预后评估的潜在分子标志物，为发展临床诊疗新策略提供理论基础。

2.1 抑癌基因p16(p16-INK4A，p16) 在细胞增殖的调控中，p16蛋白与cyclin D1竞争与CDK4/CDK6的结合，发挥负性调节作用。文献报道ESCC高危区中ESCC组织、高级上皮内瘤变组织(包括原位癌)的高甲基化频率显著高于慢性食管炎组织(依次分别为P=0.003，P=0.000)［14］，这为 ESCC形成的早期已存在P16异常甲基化提供了直接证据。早期研究发现ESCC组织及其配对血清均存在p16启动区高甲基化(频率依次为81.6%和18.4%)［15］，但另一项研究中p16启动区甲基化检出率较低(ESCC组织为20%，术前血清为5.3%)［16］。伊朗东北部一个 ESCC高危家族中64.3%的成员检出外周血p16启动区异常甲基化，其中伴有类似食管癌症状但内镜检查阴性者的高甲基化率高达80%;同地区的散发ESCC患者癌组织、血清和外周血的p16甲基化频率分别为73.3%、26.6%和43.3%，且在Ⅱ、Ⅲ期肿瘤中频率更高;而其他地区的健康志愿者的血样本中均未出现高甲基化［17］，这提示外周血游离p16甲基化不仅可能更早地提供预警信号，并且可能还在一定程度上解释高危地区ESCC家族聚集的分布特性。重要的是，在食管癌前病变患者的所有血样本中，慢性食管炎及低级上皮内瘤变中未见p16甲基化，而高级上皮内瘤变和ESCC p16甲基化频率依次为8.69%和32.43%，提示p16甲基化水平随食管疾病的发展而增长，且可能只有当病变发展至高级上皮内瘤变时才能在血浆中被检出［14］，这进一步证明了血浆P16异常甲基化可以协助临床早期发现ESCC。

2.2 脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad，

FHIT)FHIT是一种抑癌基因，在和环境致癌因素密切相关的肿瘤表达明显降低。其启动区过甲基化导致其蛋白表达的改变在食管癌的发生、发展中发挥重要作用。类似的观点已在外周血、组织标本的配对研究中得到验证，且外周血游离FHIT甲基化可能有利于高发地区ESCC的早期筛查。该研究中高危地区的食管癌前病变组织和ESCC组织FHIT甲基化发生率分别是35.29%和67.57%。配对的外周血游离FHIT甲基化检出率随疾病的发展而增加:慢性食管炎和低度上皮内瘤变均为0%，而高度上皮内瘤变和ESCC分别为8.70%和37.84%［18］。此研究为进一步探索ESCC与食管癌前病变、食管炎在外周血游离DNA甲基化的不同机制提供了直接依据。

2.3 O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT) MGMT 是一种高效的DNA直接修复酶，可修复由烷化剂引起的DNA损伤，因而在DNA修复中发挥重要作用。江苏淮安的91例新诊断ESCC的研究发现，癌组织中MGMT的甲基化频率明显高于癌旁组织(P＜0.01)，说明其异常甲基化可增加ESCC患病风险(比值比 OR=7.750，95%可信区间 CI:2.736～21.955)。同时，其在血浆与癌组织之间具有显著相关性(Kappa=0.603，P＜0.01)，提示血浆游离MGMT启动子甲基化可为ESCC的筛查、早期诊断及预后判断提供有价值的信息［15］。关于MGMT基因启动子区异常甲基化导致其mRNA转录障碍的机制尚需进一步研究。

2.4 Ras相关区域家族1A(ras-association domain family 1 A，RASSF1A) RASSF1A作为一种新型抑癌基因，在肿瘤中表达失活主要是由于启动子CpG岛的特异性高甲基化。中国高发区的30例ESCC患者的研究中，癌旁正常食管组织RASSF1A甲基化率为13%，明显低于癌组织中40%(P＜0.05);而其在外周血中为23.3%，与癌组织的甲基化差异无统计学意义，但同一个体的癌组织和外周血阳性一致率达58%，阴性率完全一致，提示外周血游离RASSF1A甲基化可以反映同一个体组织中RASSF1A基因甲基化的状态，因而可能是ESCC高危人群筛查重要候选分子标志之一。另外，外周血甲基化阳性与淋巴结转移相关(P＜0.05)［17］。

2.5 Runt相关转录因子3(runt-related transcription factor 3，RUNX3)RUNX3是一种肿瘤抑制基因，在多种肿瘤中表达沉默。一项研究显示，ESCC组织RUNX3启动子甲基化频率为64.3%(27/42)，对应的相邻正常组织均为0%;RUNX3启动子甲基化与患者临床分期相关，Ⅲ、Ⅳ期患者癌组织检出率(83.3%)显著高于Ⅰ、Ⅱ期(38.9%)(P=0.003)［14］。目前只有国内报道外周血中游离RUNX3甲基化在ESCC的研究，ESCC患者血清RUNX3基因启动子区域异常甲基化检出率为51.4%(n=70)，健康志愿者均为0%，差异有统计学意义(P＜0.001)，提示其可成为早期诊断的分子标志物。同时，Ⅲ、Ⅳ期患者癌组织RUNX3基因异常甲基化发生率显著高于Ⅰ、Ⅱ期(P=0.027)，且伴淋巴转移者的过甲基化频率明显高于无淋巴结转移者(P=0.032)，但对应的外周血游离RUNX3甲基化与远处转移无关，这可能与Ⅳ期样本较少有关，尚需进一步研究［16］。

2.6 错配修复基因1(human mutL homolog 1，hMLH1)hMLH1表达上调或下调启动子甲基化可能是其表达沉默的重要原因之一，从而导致DNA错配修复能力低下、癌症风险增高。一项包含47例ESCC的良恶性食管疾病对照研究(n=124)发现，尽管食管炎与内镜下正常食管组织间hMLH1甲基化状态差异无统计学意义，但癌和癌前病变组织的hMLH1高甲基化率则较前两者显著增加(P＜0.01)［19］。这说明其异常甲基化可增加食管磷癌的患病风险。然而，该研究中仅14.5%的组织和外周血能同时测到hMLH1过甲基化，且外周血与组织间该基因甲基化无显著关联(r=0.26，95%CI 0.09～0.41)［19］。当然，这也可能是样本量不足等因素引起的，故需要更大规模的研究来证实血中游离该基因的异常甲基化能否协助ESCC的早期诊断。

2.7 腺瘤性结肠息肉病基因(adenomatous polyposis coli，APC)及死亡相关蛋白激酶(death associated protein kinase，DAPK)APC是Wnt信号传导通路中重要的抑癌基因，参与修复细胞DNA。一项包括ESCC、腺癌的研究提及癌组织APC启动子过甲基化频率为50%(16/32)，血浆为6.3%(2/32)。但此研究主要集中于食管腺癌，并未深入探求外周血甲基化与ESCC的关系［20］。DAPK是一种负责启动细胞凋亡的蛋白激酶，对防止肿瘤的发生及遏制肿瘤的发展具有重要意义。一项研究(35例食管腺癌，24例ESCC)发现术前联合外周血游离DAPK、APC启动子甲基化有助于更好地估计食管癌患者术后的生存概率，其中APC甲基化可能作为术后检测肿瘤是否明显残留的标志物(P=0.03)［21］。当然，该研究以食管腺癌为主，其结论尚需进一步研究来印证，例如增加ESCC样本、补充相应组织以及正常人血标本的对比检测。

2.8 溶质载体家族5成员8基因(solute carrier family 5 member 8，SLC5A8)SLC5A8是一种新的候选肿瘤抑制基因，在人类的结肠癌、胃癌中表达降低或缺失。虽然在多种肿瘤中可检测其启动子高甲基化，但在国外至今仍无报道SLC5A8基因甲基化与ESCC的关系。国内一项45例食管癌癌组织(其中34例鳞癌，11例腺癌)的研究发现癌组织SLC5A8基因甲基化频率(68．8%)显著高于相应的癌旁(11.1%)及切缘组织(4.4%)，P＜0.01;其中30例患者术前血浆该基因过甲基化检出率(43.3%)显著高于对应的术后血浆(16.7%)，P＜0.05。同时，所有组织甲基化阴性者的外周血甲基化也均为阴性［22］。该研究提示它是食管癌发生的重要早期分子事件之一，血浆中SLC5A8基因甲基化检测可作为术前诊断的重要参考指标。但这种血浆甲基化状态的变化是否与食管癌的预后与转归存在关系，以及化放疗是否也可改变血浆游离DNA甲基化状态，这些均尚未清楚。

2.9 受体型蛋白酪氨酸磷酸酶O(protein tyrosine phosphatase receptor-type O，PTPRO) PTPRO 是新近发现的受体型蛋白酪氨酸磷酸酶。我们实验室首次发现ESCC患者外周血样本PTPRO基因过甲基化仅存在肿瘤组织同样过甲基化的病例(20/36，55.6%)，但尚未发现其与ESCC分化程度、浸润深度、肿瘤临床分期存在统计学相关(P＞0.05)［23］，这也提示我们需要增加样本和细胞实验进一步验证。

3 外周血游离DNA甲基化与药物敏感性:ESCC个体化治疗的机遇

很多病例即使从现行标准判断预后较好，但治疗后仍发生复发及远处转移等不良事件，不同患者采用相同化疗方案所取得的疗效却存在巨大差异。而且已有研究发现肿瘤异质性、治疗的作用可能导致肿瘤的基因表达或突变发生改变，继而改变肿瘤对药物的敏感性［24］。另一方面，在肿瘤中基因启动区高甲基化事件发生频率比基因突变更高［25］，这提示在反映肿瘤基因改变时DNA甲基化比突变更敏感。

目前临床最快也要化疗2周期后通过影像学、查体等检查才能确定疗效，这种相对滞后性无疑增加了ESCC患者不必要的化疗负荷，更耽误了及早控制病灶的宝贵时机。因此，实时监测肿瘤的性质(基因)并预测ESCC的治疗反应有可能真正实现个体化合理用药并获取最大临床效益。但临床常规的组织病理检查，常常因其量少仅能满足确诊，而难以多次重复取材以满足检测ESCC肿瘤性质的变化。

p16、RUNX-3、MGMT基因DNA启动区甲基化水平及发生率在放化疗敏感的食管癌患者癌组织中均明显低于不敏感的患者癌组织(P=0.003)［26］。更有启发意义的是，有研究表明BRCA1基因甲基化可预测卵巢癌以铂类为基础的化疗反应，而ESCC的化疗亦以铂类为基础［27］;外周血游离 RASSF1A基因DNA甲基化状态变化可能用于判断乳腺癌术后他莫昔芬治疗的敏感性［28］;外周血游离14-3-3-σ基因DNA启动区甲基化变化的不同模式可能预测转移性乳腺癌的治疗反应［29］。尽管尚未有文献报道关于外周血游离DNA甲基化指导ESCC个体化用药的研究，但上述资料提示外周血游离DNA甲基化很可能作为监测ESCC肿瘤性质变化以及预测抗癌药物治疗敏感性的分子标志物，进而成为筛选治疗优势人群并成为指导ESCC个体化治疗的新手段。

4 结论

目前国内外临床尚无成熟可靠的ESCC分子生物标志物，而无创、简便并可随时实施的外周血游离DNA甲基化检测，不再受肿瘤组织取材不便的限制，对ESCC早期诊断、预警转移复发及随访均已显示出巨大的积极意义。由于报道的相关基因有限，将其应用于临床还有待开展更多大样本量的肿瘤相关基因的临床研究来验证。另外，相关研究仍偏少，且局限在早期诊断和预后，而至今仍无外周血游离DNA甲基化与ESCC个体化治疗的研究。鉴于外周血游离DNA甲基化已被证明可在不少肿瘤中预测抗癌药物治疗反应，以便避免盲目用药和减少放化疗的不良反应，这对缺少组织标本的ESCC患者更为重要。所以，利用其进行分子检测和基因分型无疑代表了ESCC个体化治疗研究的新方向。再者，未来研究不仅需要建立敏感性、特异性良好的ESCC甲基化图谱，还应着眼于进一步阐明ESCC发生、发展的具体DNA甲基化机制，最终将外周血游离DNA甲基化检测转化于临床，使ESCC患者获益。

［1］Parkin DM，Bray F，Ferlay J，et al．Global cancer statistics，2002［J］．CA Cancer J Clin，2005，55(2):74-108．

［2］Leon SA，Shapiro B，Sklaroff DM，et al．Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy［J］．Cancer Res，1977，37(3):646-650．

［3］Correa P．Precursors of gastric and esophageal cancer［J］．Cancer，1982，50(11 Suppl):2554-2565．

［4］Stroun M，Anker P，Maurice P，et al．Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients［J］．Oncology，1989，46(5):318-322．

［5］Sorenson GD，Pribish DM，Valone FH，et al．Soluble normal and mutated DNA sequences from single-copy genes in human blood［J］．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，1994，3(1):67-71．

［6］Cui L，Xu LY，Shen ZY，et al．NGALR is overexpressed and regulated by hypomethylation in esophageal squamous cell carcinoma［J］．Clin Cancer Res，2008，14(23):7674-7681．

［7］Haruki S，Imoto I，Kozaki K，et al．Frequent silencing of protocadherin 17，a candidate tumour suppressor for esophagealsquamous cell carcinoma［J］．Carcinogenesis，2010，31(6):1027-1036．

［8］Adams L，Roth MJ，Abnet CC，et al．Promoter methylation in cytology specimens as an early detection marker for esophagealsquamous dysplasia and early esophageal squamous cell carcinoma［J］．Cancer Prev Res(Phila)，2008，1(5):357-361．

［9］Oka D，Yamashita S，Tomioka T，et al．The presence of aberrant DNA methylation in noncancerous esophageal mucosae in association with smoking history:a target for risk diagnosis and prevention of esophageal cancers［J］．Cancer，2009，115(15):3412-3426．

［10］Mandelker DL，Yamashita K，Tokumaru Y，et al．5 promoter methylation is an independent prognostic factor for esophageal squamous cell carcinoma［J］．Cancer Res，2005，65(11):4963-4968．

［11］Gyobu K，Yamashita S，Matsuda Y，et al．Identification and validation of DNA methylation markers to predict lymph node metastasis of esophageal squamous cell carcinomas［J］．Ann Surg Oncol，2011，18(4):1185-1194．

［12］Esteller M，Sanchez-Cespedes M，Rosell R，et al．Detection of aberrant promoter hypermethylation of tumor suppressor genes in serum DNA from non-small cell lung cancer patients［J］．Cancer Res，1999，59(1):67-70．

［13］Hoque MO，Feng Q，Toure P，et al．Detection of aberrant methylation of four genes in plasma DNA for the detection of breast cancer［J］．J Clin Oncol，2006，24(26):4262-4269．

［14］Long C，Yin B，Lu Q，et al．Promoter hypermethylation of the RUNX3 gene in esophageal squamous cell carcinoma［J］．Cancer Invest，2007，25(8):685-690．

［15］肖志平，刘冉，许婧，等．DNA修复酶基因MGMT启动子区异常甲基化与食管癌的关系［J］．癌变·畸变·突变，2009，21(2):105-108．

［16］郑芸，张有为，陈龙邦．食管鳞癌患者血清RUNX3基因甲基化检测及临床意义［J］．癌症进展，2010，8(3):290-294．

［17］秦豫培，王立东，常志伟，等．食管癌组织与外周血RASSF1A甲基化的检测及其临床意义［J］．中华肿瘤防治杂志，2009，16(5):359-361．

［18］Guo XQ，Wang SJ，Zhang LW，et al．DNA methylation and loss of protein expression in esophageal squamous cell carcinogenesis of high-risk area［J］．J Exp Clin Cancer Res，2007，26(4):587-594．

［19］Vasavi M，Ponnala S，Gujjari K，et al．DNA methylation in esophageal diseases including cancer:special reference to hMLH1 gene promoter status［J］．Tumori，2006，92(2):155-162．

［20］Kawakami K，Brabender J，Lord RV，et al．Hypermethylated APC DNA in plasma and prognosis of patients with esophageal adenocarcinoma［J］．J Natl Cancer Inst，2000，92(22):1805-1811．

［21］Hoffmann AC，Vallbohmer D，Prenzel K，et al．Methylated DAPK and APC promoter DNA detection in peripheral blood is significantly associated with apparent residual tumor and outcome［J］．J Cancer Res Clin Oncol，2009，135(9):1231-1237．

［22］雷霆，黄磊，胡祥．抑癌基因SLC5A8在食管癌组织及血浆中的甲基化状态分析［J］．肿瘤，2009，29(4):379-382．

［23］You YJ，Chen YP，Zheng XX，et al．Aberrant methylation of the PTPRO gene in peripheral blood as a potential biomarker in esophageal squamous cell carcinoma patients［J］．Cancer Lett，2012，315(2):138-144．

［24］Pao W，Miller VA，Politi KA，et al．Acquired resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib is associated with a second mutation in the EGFR kinase domain［J］．PLoS Med，2005，2(3):e73．

［25］Schuebel KE，Chen W，Cope L，et al．Comparing the DNA hypermethylome with gene mutations in human colorectal cancer［J］．PLoS Genet，2007，3(9):1709-1723．

［26］Hamilton JP，Sato F，Greenwald BD，et al．Promoter methylation and response to chemotherapy and radiation in esophageal cancer［J］．Clin Gastroenterol Hepatol，2006，4(6):701-708．

［27］Chaudhry P，Srinivasan R，Patel FD．Utility of gene promoter methylation in prediction of response to platinumbased chemotherapy in epithelial ovarian cancer(EOC)［J］．Cancer Invest，2009，27(8):877-884．

［28］Fiegl H，Millinger S，Mueller-Holzner E，et al．Circulating tumor-specific DNA:a marker for monitoring efficacy of adjuvant therapy in cancer patients［J］．Cancer Res，2005，65(4):1141-1145．

［29］Zurita M，Lara PC，del Moral R，et al．Hypermethylated 14-3-3-sigma and ESR1 gene promoters in serum as candidate biomarkers for the diagnosis and treatment efficacy of breast cancer metastasis［J］．BMC Cancer，2010，10:217．

R735.1

A

2095-3097(2012)01-0044-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2012.01.012

国家自然科学基金资助项目(81071736，30973508)

515041广东汕头，汕头大学医学院附属肿瘤医院中西医结合科(李宗泰，张 灏)

张 灏，E-mail:haozhang@stu.edu.cn

2012-05-06 本文编辑:徐海琴)