粪便顶管毛蚴孵化法应注意的问题

王文忠，李雪霞，丁福先

(1.洱源县动物疫病预防控制中心，云南 洱源 671200;2.大理州动物疫病预防控制中心，云南 大理 671000)

随着血防各项工作的顺利进行，大理州血吸虫病已得到有效控制，原来的重疫区变为轻疫区，轻疫区则达传播控制或传播阻断。在此情况下，监测工作显得尤为重要，在家畜血吸虫病监测工作中，最有效且常用的方法为粪便顶管毛蚴孵化法。正确掌握、使用粪便顶管毛蚴孵化法，提高阳性检出率，对巩固血防成果，防止疫情反弹具有重要意义，结合实际工作，谈一谈实际操作中应注意的问题。

1 粪便的采集

要求新鲜，足量，无污染。

1.1 采粪量

因每条成虫每天产卵及排到肠道内的卵数量一定，故应根据不同畜种每日排粪量确定采粪量，以保证所采粪量内虫卵的数量。一般牛、马属等大家畜采300 g，猪采100 g，羊、犬采50 g(一粪三检时的采粪量)。

1.2 采粪方法

最好于清晨采取新排出的粪便或从家畜直肠中采取。

1.2.1 拾粪

确认粪畜后用竹筷采取最新鲜粪便，尽可能采取带有肠黏液或带血粪便，做到一畜一筷，用过的竹筷经清洗消毒后再用。

1.2.2 掏粪

当畜群混圈分不清粪便或其他需要的情况下，须逐头掏粪采取，每采完一头更换一次手套，如为徒手采取，每采完一头应彻底洗手。

1.3 包装送检

粪样用塑料袋或塑料薄膜包装，也可用纸张、宽阔的瓜叶、菜叶、树叶包扎，但须包扎妥当，以免相互污染。禁用农药、化肥或其他物质污染过的材料或纸杯包装，以免影响毛蚴孵化。包装好后应及时附上送粪卡，送粪卡要逐项填明，必须用记号笔、圆珠笔或铅笔填写，以免受潮后字迹不清。

采好粪样后应及时送检，冬季防止结冰，夏季防止日晒，在化验地点应有专人登记，以免发生差错。

2 化验用水的要求

pH值6.8～7.2，无水虫和化学物质污染(包括氯气)的澄清水。

2.1 自来水

自来水为最佳化验用水，因其经过沉淀、消毒等处理后水质已澄清且不含水虫，pH值亦符合要求，余氯的处理可按每100 kg水中加入硫代硫酸钠0.4～0.8 g，0.5 h后备用或存放于容器中过20 h让余氯逸出后备用。用水时，应在水龙头上套双重尼龙绢筛以再次过滤。

2.2 井水或河水

无自来水时也可用井水或河水，但须做澄清和消毒处理。澄清水质可按每100 kg水中加入明矾5～10 g充分搅拌，但应注意明矾不宜过量，每次用完水后的缸底应清洗干净;消毒可按每100 kg水中加入含30%有效氯的漂白粉0.7 g搅拌均匀，余氯处理同上。

2.3 高温季节用水处理

水温高时，毛蚴孵出速度较快，为防止在洗粪、换水过程中将毛蚴倒掉，影响阳性检出率，必须准备1.0% ～1.2%的食盐水，代替洗粪用水以抑制毛蚴过早孵出被倒掉，但是灌瓶的孵化用水应改用清水。

2.4 低温季节用水处理

水温低于15℃时，灌瓶及顶管用水须加热处理，水温以33℃为宜，通过该处理，孵化瓶内水温可达到28℃左右。

3 检验

大面积普查时应做到一粪三检，即1个粪样取3个检查量做3个同样检查，而不是把1个检查量放在3个孵化瓶内，或者把洗好的1个检查量分成3个瓶内观察。在已达传播控制或传播阻断地区，则应用三粪六检方法检测。

所采样品应尽快检完，最迟应于当天检完，因粪便长时间放置后易孵出其它小虫或粪虫而影响观察(尤其在夏季气温高时)。此外，在检测过程中还应注意以下环节。

3.1 洗粪

洗粪应彻底，力求把血吸虫卵清洗下来。以铜筛杯滤粪时，不能随意一搅拌就把粪渣倒去，应该是三上三下地进行淘洗，即淘洗1次后，取出滤干，再淘洗，再取出滤干，这样每个样品上下反复3次，就比较彻底。以尼龙绢筛淘洗时，应顺筛口圆周形缓慢冲水，以把虫卵集到筛底。

3.2 灌瓶

灌瓶时应把尼龙绢筛内虫卵彻底冲洗下来灌入瓶中，加盖时应注意接口是否漏水并及时处理。

3.3 安顶管

顶管必须洗漂干净以利观察;顶管胶套老化松弛时应及时更换，用胶布代替胶套时应注意松紧适度，以免顶管水漏出;顶管水不宜太满或过少，以4/5为宜，以利于观察;安顶管前须在管口装一层均匀薄的脱脂棉，以既能挡住粪渣又不影响毛蚴上游为宜。

3.4 孵化

血吸虫卵的孵化须保持一定的温度(22～26℃)及光线，故环境温度低于20℃时须有保持20～25℃环境温度的条件，最好采用恒温光照培养箱，无培养箱时须在有取暖设备的房间内孵化。

3.5 观察毛蚴

毛蚴体小(长0.078～1.120mm，宽0.03～0.04mm)，难以观察，特别在轻流行区，大部分1个粪样仅孵出1～2个毛蚴，故观察毛蚴应间隔一定时间，多次观察，且每次每瓶的观察时间至少在2min以上。

3.5.1 观察时间

牛、马、羊、犬粪在进孵后1、3、5 h各观察1次，猪粪在进孵后5、8 h各观察1次;阴性者8 h后再观察1次;不能改为在第5个小时一次观察。

3.5.2 观察方法

观察毛蚴时应在光线充足的地方进行，为便于观察，可衬黑色背景并使用放大镜。观察时应注意与粪虫、水虫等其它小虫相区别，毛蚴呈梭形，针尖大小，灰白色，折光性强，和水中其它小虫明显不同处是多在近水面(顶管上1/3)作水平或斜向直线运动，且只有在触到顶管壁后才会折返(不一定立即折返，有时在管壁稍作停留)。可疑时可用滴管将虫吸出置于载玻片上镜检鉴别。为便于观察，可加一滴碘溶液将其杀死，10×10显微镜下可见毛蚴前部宽，中间有个顶突，两侧对称，后渐窄，周身有纤毛。

综上所述，在整个操作过程中，应紧紧围绕日本血吸虫生活史虫卵及毛蚴阶段的生物学特性，充分把握好以上几个环节，以提高阳性检出率。