空肠弯曲菌的培养及其PCR鉴定研究

杨胜男，郑增忍，张乐萃，王 娟，曲志娜，黄秀梅，李玉清

（1.青岛农业大学，山东青岛266109；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛266032）

弯曲菌（Campylobacter）是重要的食源性人兽共患病原菌［1］，可引起人和动物的各种疾病，如人类发热、急性肠炎和格林-巴利综合征［2-3］。在兽医学上，可引起家畜流产、不孕、乳房炎及幼畜禽腹泻和家禽肝炎［4］。家畜和野生鸟类是其常见宿主，人类常因为摄入被污染的食物和饮水而感染［5］。而家禽类尤其是鸡源产品更是弯曲菌感染传播的重要途径［6］。因此，研究弯曲菌具有重要的公共卫生学意义［7］。弯曲菌培养条件十分苛刻，25℃不生长，42℃生长较好，微需氧条件，普通培养基上生长不良，生长需要万古霉素、多黏菌素B等抗菌药物的血琼脂培养基［8-9］。而常规生化鉴定则耗时费力，过程复杂。本试验优化了弯曲菌的分离培养过程，以利于后续检测工作的进行，并建立空肠弯曲菌的PCR检测鉴定方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 空肠弯曲菌标准菌株ATCC 33560由中国动物卫生与流行病学中心实验室提供，大肠埃希菌ATCC25922购自中国兽药监察所，金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 29213购自中国药品生物制品检定所。

1.1.2 试剂及培养基 弯曲菌CCDA琼脂、哥伦比亚血琼脂基础为英国OXOID公司产品；绵羊全血为青岛海博生物科技公司产品；TTC琼脂为北京陆桥生物科技公司产品；2×Taq PCR Master Mix、PCR Marker为宝生物工程（大连）有限公司产品；厌氧罐、微需氧产气袋为日本MGC公司产品；常规试剂为国产分析纯试剂。

1.1.3 样本采集 采集青岛地区鸡盲肠包装，低温条件下运送至实验室。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养 用接种环沾取少量鸡盲肠内容物，划线接种到CCDA选择性培养基上，置于微需氧培养罐内，42℃培养48h。进行2次传代培养，选取可疑菌落接种于TTC琼脂平板培养，阳性者为紫色菌苔并有光泽，挑取单菌落接种于哥伦比亚血琼脂培养基进行纯培养。

1.2.2 菌株API鉴定 挑选出氧化酶阳性的菌株，用接种环从哥伦比亚血琼脂培养基上选取纯培养物，制成6麦氏单位的菌悬液，根据弯曲菌API鉴定条（API20800）说明进行操作接种并培养，判读培养结果，查阅API20800鉴定标准进行菌株鉴定。

1.2.3 PCR方法的建立

1.2.3.1 PCR引物设计与合成 根据GenBank上发表和Nielsen等［10-12］报道的序列，针对空肠弯曲菌16 S rRNA基因设计引物，上游引物为5′-CATCTTCCCTAGTCAAGCCT-3′，下游引物为5′-AAGATATGGCACTAGCAAGAC-3′，扩增产物长度为773bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.3.2 模板DNA的提取 用接种环从哥伦比亚血琼脂培养基上挑取适量的纯培养物置于盛有1mL PBS的Eppendorf管中，13 500r／min离心5min，去上清。重复一次离心步骤后，用200μL TE（Tris-EDTA，10∶1）重悬沉淀，放入100℃沸水中煮沸5min～10min。取出置于冰浴中冷却5min后，13 500r／min离心3min，取上清液作为PCR模板。

1.2.3.3 PCR反应体系 模板DNA 2μL，上、下游引物（20pmol／μL）各0.5μL，2×TaqGreen Mix 12.5μL，灭菌蒸馏水补足至25μL。PCR循环参数：94℃ 5min；94℃ 1min，64℃ 1min，72℃1min，2个循环；94℃ 1min，62℃ 1min，72℃ 1 min，2个循环；94℃1min，60℃1min，72℃1min，2个循环；94℃1min，58℃1min，72℃1min，2个循环；94℃1min，56℃1min，72℃1min，2个循环；94℃1min，54℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。

1.2.3.4 PCR扩增产物的鉴定 10g／L琼脂糖凝胶按3mg／L加溴化乙锭（EB）制胶。取8μL PCR扩增产物加样。用DNA Marker DL 2 000对照。110V电压，电泳40min，置于凝胶成像系统拍照和分析电泳结果。

PCR产物的测序鉴定，取PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.2.3.5 特异性试验 用本试验建立的PCR方法，对分离获得的空肠弯曲菌以及空肠弯曲菌ATCC、大肠埃希菌ATCC、金黄色葡萄球菌ATCC等对照菌株提取DNA进行检测，从而确定其特异性。

2 结果

2.1 细菌培养

本试验根据情况采用弯曲菌CCDA选择性培养基、TTC琼脂和哥伦比亚血琼脂基础培养基，弯曲菌在血琼脂培养基上不溶血，在CCDA选择性培养基上典型菌落形态为圆形，光滑，灰色，闪金属光泽，菌落较小且容易连成串珠状。TTC琼脂上成紫色发亮菌落，单菌落较明显，易于选取进行传代培养。哥伦比亚血琼脂上菌落呈浅灰色或黄褐色。

2.2 PCR方法的特异性

选用建立的PCR方法可扩增出空肠弯曲菌的特异性片段，而金黄色葡萄球菌ATCC，大肠埃希菌ATCC均不能扩增出特异性片段。通过凝胶成像系统对该特异片段进行迁移率计算，其大小为773bp，与预期的片段相符（图1）。

2.3 方法应用

应用上述建立的弯曲菌分离培养及PCR方法，我们从100份新鲜鸡盲肠样品中分离出23株空肠弯曲菌，分离率为23%。

2.4 PCR方法的验证

对PCR鉴定的空肠弯曲菌进行API验证，其鉴定结果与PCR结果一致。证明上述空肠弯曲菌PCR方法可应用在临床菌株分离鉴定工作中。

图1 PCR特异性试验Fig.1 The specificity test of PCR

3 讨论

盲肠内容物初代接种在CCDA选择性培养基上培养，容易生长出连成串珠状的菌落，对典型单菌落的选取造成干扰，不利于进行传代培养；而在TTC琼脂上进行生化鉴定，培养后长出的单菌落易于选取，利于纯化培养单菌落。结果表明，经过CCDA选择性培养，TTC琼脂培养后更容易选取典型单菌落，有利于回归接种CCDA培养基、哥伦比亚血琼脂培养基纯化菌株。为保存菌种和PCR鉴定提取模板提供有利条件。

何蕊等［13］应用mapA基因和16S基因建立的检测空肠弯曲菌、弯曲菌的PCR方法，可扩增出589bp的特异性片段和857bp的特异性片段，但部分肠道菌扩增出非特异性片段；娜仁高娃等［14］根据空肠弯曲菌hipO基因建立的PCR鉴定方法，并非所有空肠弯曲菌都能扩增出149bp特异性片段。本试验所建立的PCR方法有较强特异性，结果显示，空肠弯曲菌扩增出特异性条带，而其他参考菌株均未扩增出条带，说明该方法有较强特异性。

综上所述，经过优化的分离培养有利于纯化菌株，更有利于PCR鉴定检测及菌种的长期保存。

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