犬／细／小／病／毒／性／肠／炎／的／诊／断

雷程红，赵文年，樊红春，龚晓伟，李新鹏，马 林

（1.新疆农业大学动物医学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

犬细小病毒性肠炎，以剧烈呕吐、腹泻和白细胞显著减少为其临床特征，病初发热，精神沉郁，不食，呕吐，腹泻，随着病情的发展，粪便由稀状变为咖啡色或番茄酱色样的血便并带有特殊的腥臭气味。该病发病率高，如果得不到正确诊断和及时治疗，死亡率也高。最近，乌鲁木齐市宠物犬发生疑似细小病毒性肠炎流行，我们结合临床表现，采用两种方法对该病进行了诊断，并对这两种方法做了比较。

1 材料与方法

1.1 材料 病料，采集以呕吐、腹泻为临床表现的宠物犬的粪便，共68例。猪红细胞，采集6～8月龄健康猪全血。犬细小病毒单克隆抗体，购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司。犬细小病毒检测试纸，购自韩国安捷公司。96孔90°V型微量反应板，微量加样器和吸头，1.5mL离心管，微量振荡器，常用冰箱，温箱，摇床，离心机。

1.2 方法

1.2.1 检测试纸法 按照说明书进行，即：用棉签收集犬粪，将棉签浸入装有1mL反应缓冲液的样品收集管中，充分混匀，将混合液4滴缓慢地加到试纸上的样品孔中，5～10min内判定结果。

1.2.2 HA－HI法

1.2.2.1 粪便处理 用棉签收集犬粪，放入无菌的装有1mL生理盐水的小离心管内，反复涮洗几次后弃去棉签。将粪便样品反复冻融3次，13000r／min离心10min，吸取上清液放入另一无菌小离心管内，加入1／10体积的氯仿抽提混匀，3000r／min离心10min，液体分为两层，小心吸取上层液体即为待检样品，－20℃冻存备用。

1.2.2.21 %猪红细胞悬液制备 无菌采集猪全血放入阿氏液中，血与阿氏液的比例为1∶9，迅速轻轻混匀，用10～20倍的生理盐水洗涤3～4次，每次2000r／min离心5min，再用0.2mol／L，pH 值7.2的PBS洗涤1次，2000r／min离心5min。弃上清液体，用0.2mol／L，pH 值7.2的PBS将红细胞配制成1%猪红细胞悬液，4℃保存备用。

1.2.2.3 醛化红细胞制备 见郭鑫［1］和符子华［2］的方法。

1.2.2.4 HA－HI方法 见秦海斌等人［3］的方法。即：在96孔板中进行操作。用生理盐水倍比稀释处理好的粪便样本25μL至第11孔，第12孔做阴性对照，每孔加1%猪红细胞悬液25μL，振荡混匀后4℃静置3h后读取结果。以使猪红细胞100%凝集的最高稀释倍数为样本中病毒液的红细胞凝集效价。以该凝集效价配4单位病毒，用生理盐水稀释犬细小病毒单克隆抗体25μL至第10孔，第11孔做红细胞对照，第12孔做抗原对照，加4单位病毒25μL，振荡混匀之后放置37℃温箱作用30min，每孔加入1%猪红细胞悬液25μL，振荡混匀后4℃静置3h后读取结果。

2 结果与分析

2.1 试纸法的检测结果 检测的68例粪样均为阳性，即68例病犬都是犬细小病毒性肠炎。

2.2 HA－HI的结果 68个样本中，63个的效价大于或等于1∶16且能被犬细小病毒单克隆抗体所抑制，为阳性，其余5个为阴性，阳性率为92.6%。检测结果见表1。

表1 检测试纸法和HA－HI诊断犬细小病毒结果

2.3 两种方法的比较 从检测结果看，试纸法的敏感性比HA－HI高，但特异性低；HA－HI的特异性高但敏感性低，两者的阳性符合率为92.6%。

3 讨论

3.1 试纸法是目前宠物门诊最常采用的诊断方法［4］，其原理是免疫层析，即待检粪样（抗原）加到试纸条一端的样本垫上，通过毛细作用向前移动，遇到结合垫上的金标抗体后互相反应，再移动至固定的抗体区域与之结合而被截留，聚集在检测带上，出现肉眼可见的显色结果。该法敏感性高、简单快速方便。我们用该法诊断68例病犬，其结果全部为细小病毒病，这与发病犬的临床表现基本相符。

3.2 HA－HI是检测犬细小病毒病的国标方法［5］，其原理是犬细小病毒有凝集猪红细胞的能力，这种凝集能力又可被犬细小病毒特异性抗体所抑制。该法特异性高。我们用该法诊断68例病犬，其结果是63例为细小病毒病，这与发病犬的临床表现也相符。

3.3 两种方法的检测结果中有5例结果不相符，其原因何在？分析试纸法，其假阳性是人为因素或是试纸本身造成国内有关这方面的报道很少，我们对这不相符的5例粪便采用离心处理后又用试纸法检测1次，结果4例为阴性，1例仍然是阳性。这说明造成假阳性结果的原因可能是粪便中的其他成分与试纸中抗体发生非特异性结合所致。分析HA－HI，其假阴性可能与肠道内出现犬细小病毒抗体有关［6－7］，也可能与样品的处理、操作及加样的准确、器材的干净、溶液的无菌等多种人为因素有关［1］。

3.4 上述两种方法在临床诊断中各有优缺点，从快速简便来看，选择试纸法较好，因为试纸法操作步骤少，耗时几分钟，而在HA－HI试验中，步骤多，耗时3～4h，且新鲜红细胞需要不断采集和制备，很不方便；从结果的准确性看，选择HA－HI方法较好，因为该法的特异性比试纸法的要高。

4 结语

4.1 这次在宠物犬中流行的是犬细小病毒性肠炎。

4.2 HA－HI方法检测时间较长，影响因素比较多，但经济实惠；目前门诊上普遍采用的试纸法，方便快捷，只要对粪便事先处理，其假阳性会降低。

4.3 要得到准确的临床诊断结果，最好同时采用这两种方法来互补。

［1］ 郭鑫.动物免疫学实验教程［M］.北京：中国农业大学出版社，2007：55.

［2］ 符子华.用醛化猪红细胞进行犬细小病毒HA和HI试验［J］.新疆农业科学，1993（3）：133－134.

［3］ 秦海斌，张汇东，缪勤，等.犬细小病毒血凝的检测和血凝抑制试验方法的优化［J］.中国比较医学杂志，2009，19（7）：49－52.

［4］ 吴洁，刘强，侯宇成，等.新疆石河子市犬细小病毒病流行病学调查［J］.北京农业，2011（15）：80－82.

［5］ 史利军，曾妮，李刚.犬细小病毒生物学特征及检测技术研究进展［J］.动物医学进展，2010，31（4）：82－85.

［6］ 夏咸柱，李六金，武德丽，等.犬细小病毒性肠炎的诊断研究－犬细小病毒血凝和血凝抑制试验［J］.中国人民解放军兽医大学学报，1983，3（2）：144－148.

［7］ 贾补年.犬细小病毒的电镜和免疫电镜观察［J］.家畜传染病，1983（3）：11－13.