重庆彭水野生美味牛肝菌菌丝分离与鉴定*

王正春，蒋海艳，杨笑笑，李月文，李继晖，郑凌凌

（1.重庆市林业科学研究院，重庆 400036；2.西南大学资源环境学院，重庆 400715；3.彭水自治县林业科技推广站，四川 彭水 409600）

牛肝菌属是担子菌亚门（Basidiomycotina）、层菌纲（Hymenomycete）、 伞菌目（Agaricales）、 牛肝菌科（Boletaceae）的一类珍稀大型菌根食用真菌。重庆生长的牛肝菌以彭水 “大脚菌”即美味牛肝菌最有名气，味道鲜美，营养丰富，具有高经济价值。市场上消费的美味牛肝菌主要是野生，目前尚未见人工栽培的报道。近年来，由于人们过度采集及不合理采集，野生资源正逐年减少，为使这一宝贵资源得到可持续利用，对其采取保护措施和人工驯化繁育势在必行。通过对重庆武陵山区彭水野生美味牛肝菌菌丝的分离培养，为美味牛肝菌的菌根菌合成和人工驯化作好基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 分离材料

白牛肝菌，菌盖淡褐色，菌褶白色，菌柄粗壮，淡黄色；黄牛肝菌，菌盖为黄褐色，菌柄为烤面包的皮壳色。2种子实体，于2011年6月18日采摘于重庆武陵山彭水朗溪乡青冈纯林内，海拔为700 m左右。2种牛肝菌的子实体情况见图1。

图1 2种牛肝菌的子实体情况

1.1.2 培养基

固体培养基：①葡萄糖 20 g、酵母粉 7.0 g、黄豆粉3.0 g、 KH2PO41.0 g、 MgSO4·H2O 0.5 g、 MgSO4·7H2O 0.5 g、琼脂 20.0 g，水 1000 mL[1]；②马铃薯 200 g、葡萄糖20 g、 KH2PO43 g、 MgSO4·7H2O 1.5 g、 琼脂 20 g、 VB110 mg，水 1000 mL。

液体培养基：③葡萄糖 20 g、麦芽糖5 g、KH2PO41 g、 MgSO4·7H2O 0.5 g、 VB11 mL，水 1000 mL，pH 6.0；④葡萄糖 20 g、 酵母浸出膏 7.0 g、MgSO4·7H2O 1.0 g、KH2PO42.0 g、 VB10.01 mg，水 1000 mL，pH 5.2～5.8[2]。

1.2 方法

1.2.1 菌丝分离、培养

采摘的子实体放入干净、透气的盒子，立即带回实验室进行处理。选取新鲜幼嫩、无病虫害的完整子实体，采用组织分离法，无菌操作，及时进行分离。子实体表面用75%酒精进行消毒，然后切取菌柄与菌盖交界处[3]大小为(0.2×0.2)cm～(0.4×0.4)cm的组织块接入培养基中，分别做好标记，并注明日期，放入恒温恒湿培养箱中进行培养。尽可能将组织块接入较多的斜面培养基。培养条件为25℃，相对湿度70%，无光照。4 d～5 d后检查培养基斜面是否有污染，有污染者及早剔除。

菌丝生长旺盛时，挑取少许菌丝转接到新的培养基中，标注后，放入恒温恒湿培养箱中进行培养。整个转接过程在无菌的环境下进行，每隔2 d检查，剔除污染严重的培养基。

1.2.2 液体培养

液体培养基配制好后，进行分装。100 mL三角瓶装液量为40 mL，高压灭菌121.1℃、30 min，冷却后保存于冰箱备用。挑取少许健壮的菌丝接入液体培养基中，注明菌种名称、编号、日期。在27℃条件下静置24 h后，放入恒温震荡箱中进行培养，培养条件为27℃、转速为160 r·min-1。

1.2.3 菌丝鉴定

菌丝经过液体培养后。将三角瓶中的液体及菌丝过滤，进行ITS鉴定[4]，具体方法跟 “武陵山区羊肚菌菌丝鉴定及分析”中羊肚菌菌丝鉴定相同。以ITS1和ITS4为引物进行PCR扩增得到的rDNA-ITS区段经过测序后，登陆www.ncbi.nlm.nih.gov进行BLAST比对。

1.2.4 菌种保藏

菌丝体经过鉴定，确认为美味牛肝菌后，进行低温冷冻保藏。具体方法：信封高温灭菌、滤纸进行高温灭菌待用，取培养的菌丝体，过滤，将滤纸放入信封中，注明菌种名称、日期、编号等，放入-80℃超低温冰箱中进行保藏。

2 结果与分析

2.1 菌丝生长情况

在分离培养基上，菌丝从组织块边缘萌发长出，生长较好，但不向周围的培养基中蔓延，老化的程度较快，老化过程中菌丝减少，最后变为固体块状物，并且分泌褐色水珠。菌丝生长情况见表1，菌丝图片见图2。

由图2可知，白牛肝菌和黄牛肝菌在2种培养基上菌丝的萌发速度和生长情况差别不是很大，菌丝也生长较好，但菌丝在培养基②上生长比培养基①的老化速度要快，因此，培养基①可以作为2种牛肝菌分离的培养基。菌丝从组织块上长出后生长较好，菌丝不向组织块周围的培养基中生长，难以挑取菌丝，因此，培养基①并非牛肝菌分离的最佳培养基。

表1 2种牛肝菌菌丝在不同培养基中生长情况

图2 2种牛肝菌菌丝情况

2.2 液体培养

菌丝在液体培养基中生长缓慢，40 d后进行观察。菌丝在培养基③、培养基④培养基摇瓶中污染的几率较大。培养基③摇瓶内长出菌丝体，小而少。培养基④摇瓶中接种的菌丝几乎不生长。

2.3 菌丝鉴定

以ITS1和ITS4为引物，2种牛肝菌菌丝进行PCR扩增所得rDNA-ITS区段大小均约为700 bp,BLAST比对结果可知，2种牛肝菌的rDNA-ITS序列（图3）与Boletus edulis具有100%的相似性，从而确定2种牛肝菌与Boletus edulis是同一个种，具体分类地位如下：真菌界（Mycota）、担子菌亚门（Basidiomycotina）、层菌纲（Hymenomycetes）、 伞菌目（Agaricales）、 牛肝菌科 （Boletaceae）、牛肝菌属 （Boletus）、美味牛肝菌 （Boletus edulis Bull.:Fr）。

图3 2种牛肝菌质粒转换后凝胶电泳成像

3 讨论

菌丝分离成功较少，原因可能是牛肝菌菌丝从组织块边缘萌发长出，与组织块有密切关系，菌丝不易挑取，挑取成功的菌丝接入新的培养基中难以生长。这与王海坤、李涛等[5]报道的一致。因此，美味牛肝菌的分离、培养所需要的营养因子和培养条件有待继续研究。

组织分离法难以分离得到纯的牛肝菌菌丝，可以采用其他分离方法进行菌丝的分离，如孢子分离法。

菌种在-80℃超低温冰箱中保存的时间比较长，保存后菌种的复壮及复壮后菌丝的生长情况需进一步进行研究。

菌种培养好之后，将继续进行菌根合成试验的研究。

[1]邓百万，陈文强.美味牛肝菌母种培养基的筛选[J].福建农林大学学报：自然科学版，2004，33(3)：396-399.

[2]陈文强，邓百万.美味牛肝菌深层发酵的研究[J].四川大学学报：自然科学版，2005，42(2)：368-372.

[3]刘琼波，苏开美，白永顺，等.美味牛肝菌的菌种分离培养试验初探[J].食用菌，2007(4)：25-26.

[4]陈剑山，郑服丛.ITS序列分析在真菌分类鉴定中的应用 [J].安徽农业科学，2007，35(13)：3785-3786，3792.

[5]王海坤，李涛，赵丹丹，等.两株滇产广义美味牛肝菌的分离培养及其分子鉴定[J].云南植物研究，2007，29(5)：559-562.