罗非鱼鳞胶原蛋白提取工艺研究

2012-08-07孙宪迅孙齐英周理红

江汉大学学报（自然科学版） 2012年3期

关键词：物质量鱼鳞罗非鱼

孙宪迅，孙齐英，韩雪，周理红

（江汉大学生命科学学院，湖北武汉 430056）

罗非鱼鳞胶原蛋白提取工艺研究

孙宪迅，孙齐英，韩雪，周理红

（江汉大学生命科学学院，湖北武汉 430056）

研究用胃蛋白酶从罗非鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺。根据测定水解液中羟脯氨酸（HYP）的含量计算胶原蛋白提取率，采用单因素和正交试验确定胃蛋白酶水解鱼鳞制备胶原蛋白的适宜酶解条件。结果表明，采用底物质量分数7%，胃蛋白酶酶解罗非鱼鳞制备胶原蛋白的适宜温度、pH、加酶量、时间分别为65℃、2.0、2%、2 h。在适宜工艺条件下，胶原蛋白提取率可达94.24%。

罗非鱼鳞；胶原蛋白；胃蛋白酶

胶原蛋白在化妆品、医药、食品、饲料等领域得到越来越广泛的应用，需求量逐年增大[1-3］。从猪、牛等陆生动物皮和骨提取的方法，难以满足市场需求[4］。从水生动物中提取胶原蛋白受到重视[4-5］。鱼鳞中含有丰富的胶原蛋白和各种矿物质，一般占鱼重的5%左右[5］，极少得到利用，往往当成垃圾扔掉，不仅浪费资源，且污染环境。罗非鱼属于广盐性鱼类，海淡水中均可养殖，成为世界性的主要养殖鱼类[6］。开展从罗非鱼鳞中提取胶原蛋白的研究有较强的现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗非鱼鱼鳞：购自海南市场；胃蛋白酶（比活力为 1∶3 000）：中国医药集团上海化学试剂公司。

1.2 仪器

UX420H电子分析天平；DK-8D型恒温水浴锅；定氮仪；8028手握pH计；101A-3ET电热鼓风干燥箱。

1.3 方法

1.3.1 胶原蛋白含量的测定胶原蛋白含量测定以羟脯氨酸（HYP）计。

1）原料中胶原蛋白含量的测定。按照文献[7-8］的方法进行测定。

2）提取液中胶原蛋白含量的测定。按照文献[7-8］的方法进行测定。

3）胶原蛋白提取率的计算。

提取率/%=（提取的胶原蛋白含量/原料中胶原蛋白含量）×100。

其中胶原蛋白含量/%=HYP含量（%）× 11.1，由于HYP含量与胶原蛋白的含量是呈正相关性，将测定的HYP含量乘以相应的系数即可得出胶原蛋白的含量[8-9］。

1.3.2 鱼鳞酶解工艺流程鱼鳞→盐酸脱钙→除杂蛋白→蒸馏水清洗→烘干→酶解→过滤→上清液→干燥成品。

1.3.3 酶解工艺研究 1）鱼鳞预处理。称取10 g鱼鳞加入0.3 mol/L盐酸100 mL，浸泡40 min，过滤清洗，再用3%氯化钠（W/V）溶液来除去盐溶性和水溶性杂蛋白。

2）酶水解试验方法。①底物质量分数比对胶原蛋白的影响。将预处理鱼鳞与缓冲溶液按不同比例3%、5%、7%、9%、12%（W/W）溶于酶解反应器中，控制温度和 pH至酶适宜反应条件，按鱼鳞质量1.5%的量加入酶，在反应器中酶解一定时间。取上清液，测定胶原蛋白的含量，研究不同底物质量浓度对胶原蛋白提取的影响。②不同酶量对胶原蛋白提取的影响。分别向浆料中添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%鱼鳞质量的胃蛋白酶。调节温度、pH值和料液比至酶适宜反应条件，酶解一定时间。取上清液，测定胶原蛋白的含量，研究不同酶量对胶原蛋白提取的影响。③酶解条件的优化。根据文献 [1，9-12］，底物质量浓度采用7%，选择温度、pH值、加酶量、时间4个因素，每个因素确定 3个水平，按正交表L9（34）设计试验（见表1），以胶原蛋白提取率为测定指标，考察4个因素对酶解效果的影响。

表1 酶水解提取胶原蛋白工艺的正交试验方案

2 结果与讨论

2.1 不同料液比对胶原蛋白提取的影响

由图1可知，胶原蛋白提取率随底物浓度增大而降低，当鱼鳞质量分数从3%升高到7%时，胶原蛋白提取率降低很小。当底物浓度从7%升到9%时，胶原蛋白提取率下降很快。底物浓度增大，酶解液比较黏稠，酶与底物的结合困难，酶解效果差，严重影响提取率。底物浓度减小，酶解效果好，胶原蛋白提取率高。考虑到下游的过滤与干燥成本，采用底物浓度为7%。

图1 底物质量分数对胶原蛋白提取的影响

2.2 不同酶量对胶原蛋白提取的影响

由图2所知，胶原蛋白提取率随酶量的增大增大，当酶量从0.5%上升到1.5%时，胶原蛋白提取率增幅较大。酶量从1.5%上升到2%时，胶原蛋白提取率增幅较慢，当继续增大酶量时，没有足够底物参与反应，参与说明2%左右的酶量完全能满足酶解要求。

2.3 酶解条件的优化

图2 酶量对胶原蛋白提取的影响

表2 酶水解提取胶原蛋白工艺的正交实验结果

从表2可知，各因素对鱼鳞胶原蛋白提取率都产生显著影响。在选定范围内影响鱼鳞胶原蛋白酶解的因素按影响程度大小依次是A＞D＞C＞B，表明在本试验研究条件下，温度是影响鱼鳞胶原蛋白酶解的最关键因素，其次为时间和酶量，溶液pH值的影响最小。根据正交试验表和极差分析可知胃蛋白酶适宜酶解鱼鳞胶原蛋白工艺条件是A3B1C3D2，即酶解温度65℃、pH值为2.0，酶量2%，时间为2 h。对正交试验得到的适宜参数值进行了验证，在该适宜条件下，胶原蛋白提取率达94.24%。

3 讨论

将罗非鱼鳞用酸预处理后，利用胃蛋白酶将胶原蛋白进行有限水解，增大鱼鳞胶原蛋白的溶解度。通过单因素和正交试验，得到从罗非鱼鳞中提取胶原蛋白的适宜工艺；底物浓度7%、酶解温度65℃、pH值为2.0、酶量2%、时间为2 h，胶原蛋白提取率达94.24%。

参考文献：

[1］曹俊.鱼鳞胶原蛋白的研究进展与应用前景[J］.水产科技情报，2009，36（l）：41-44.

[2］宋芹，颜军，郭晓强，等.酶法制取罗非鱼鳞胶原蛋白寡肽的工艺[J］.食品研究与开发，2011，32（4）：39-43.

[3］刘石生，易美华，黄文艳.热水提取罗非鱼鱼鳞胶原蛋白的研究[J］.现代食品科技，2006，22（4）：139-144.

[4］王南平，郭鹏达.鱼鳞胶原蛋白的研制[J］.水产科技情报，2004，31（6）：263-264.

[5］王孟津，汪海波，桂萌，等.草鱼鱼鳞胶原蛋白的提取及其理化性质研究[J］.食品科学，2009，30（18）：113-116.

[6］刘文涛，李国英，缪煜清，等.鱼鳞的研究现状及应用前景[J］.水利渔业，2006，26（1）：20-23.

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[8］张俊杰，曾庆孝.比色法测定鱼鳞中羟脯氨酸的研究[J］.食品科技，2004（4）：83-85.

[9］郭恒斌，曾庆祝.酶法提取鱿鱼皮胶原蛋白工艺条件的研究[J］.南方水产，2008，4（1）：58-62.

[10］申锋，杨莉莉，熊善柏，等.胃蛋白酶水解草鱼鱼鳞制备胶原肽的工艺优化[J］.华中农业大学学报，2010，29（3）：387-391.

[11］徐娟，袁艳娟，屠春燕.胃蛋白酶水解绿豆分离蛋白的工艺[J］.生物加工过程，2008，6（4）：31-35.

[12］周颖，林志峰，吴琼，等.响应面法研究鱼鳞胃蛋白酶酶解特性[J］.现代农业科学，2009，16（7）：18-20.

SUN Xian-xun，SUN Qi-ying，HAN Xue，ZHOU Li-hong
（School of Life Sciences，Jianghan University，Wuhan 430056，Hubei，China）

The technology of extraction collagen from tilapia fish scales through pepsin hydrolysis has been studied.According to hydrolysate concentration of hydroxyproline（HYP），the single factor and orthogonal experiment was determined the best enzymatic hydrolysis condition. The optimum condition of temperature，pH，enzyme concentration and hydrolyzing time for the extraction is 65℃、pH 2.0、2%、2 h.The extraction rate of collagen from tilapia fish scales was 94.24%under this optimal condition.

tilapia fish scale；collagen；pepsin