热毒宁注射液对哮喘大鼠肺组织病理改变及TRAF2表达的调控作用

范广民 叶 斌 浙江省台州市中心医院 台州 317000

李绍波 浙江省台州医院

童夏生 阮正英 浙江省台州市中西医结合医院

亢晓冬 杭州师范大学钱江学院

叶 辉 浙江省台州市第一人民医院

哮喘是一种气道炎症性疾病，涉及多种炎症细胞和细胞组分，导致慢性的病理生理改变，表现为气道组织肿胀、黏液腺增生和黏液栓形成[1]。其机制十分复杂，至今尚未完全阐明。中药热毒宁注射液（成分：金银花、青蒿、栀子）具有抗炎症、抗病毒、清热解毒之功效，不仅能有效治疗上呼吸道感染、慢性支气管炎[2-3]，还能在急性肺损伤中起保护作用[4-5]，在临床上得到广泛应用。但该药对哮喘的治疗作用则鲜见报道。目前已知，肿瘤坏死因子超家族参与了哮喘气道炎症过程[6]，但其超家族成员肿瘤坏死因子受体相关因子（tumor necrosis factor receptor associated factor，TRAF）在哮喘的作用如何，目前知之甚少。本研究通过观察热毒宁注射液对哮喘大鼠肺组织病理改变和TRAF2表达的影响，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 鸡卵白蛋白（OVA）Ⅴ级购自美国Sigma公司；小鼠抗大鼠TRAF2多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；即用型SP系列检测试剂盒（其中试剂B：生物素标记二抗工作液选用SP-9000）及DAB显色剂（ZLI-9018）均购自北京中山生物有限公司。

1.2 实验动物及分组 清洁级健康雄性SD大鼠27只，4～5 周龄，体重（121±7）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2007-0005，杭州师范大学实验动物中心清洁级环境中饲养。随机分成哮喘组、对照组、热毒宁组，每组9只。

1.3 动物模型复制[7]哮喘组第1天和第8天腹腔注射OVA/Al（OH）3混合液（含OVA1mg和Al（OH）3100mg）2mL致敏，各1次。第15天开始每天向大鼠喷雾（空气压缩雾化器：PARI BOY-037G6000 GERMANY）1%OVA 30min，连续激发 7 天。造模成功后表现为烦躁不安、搔痒、喘鸣、腹肌抽搐等症状。对照组致敏和激发均以生理盐水替代OVA和Al（OH）3，热毒宁组致敏和激发方法同哮喘组，不同的是在抗原首次激发前24 h和每次激发前0.5 h给予腹腔注射热毒宁注射液（江苏康缘药业股分有限公司生产，批号 100618），1 mL/只。

1.4 肺组织标本制备 末次激发24 h后，10%水合氯醛（400mg/kg）腹腔注射麻醉，心脏抽血致死。取右肺门部位组织块，4%多聚甲醛-PBS溶液固定，常规石蜡包埋切片，HE染色后观察肺组织病理变化（OLYMPUS-CX40 JAPAN）。

1.5 免疫组化方法 采用SP法测定TRAF2的表达[8]。染色步骤如下：①石蜡切片，64℃烤片2h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ脱蜡，梯度酒精（依次100%酒精Ⅰ、Ⅱ、95%酒精Ⅰ、Ⅱ、85%酒精、75%酒精）水化，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min；②抗原修复：使用pH=6.0柠檬酸抗原修复液高压锅抗原热修复（高压锅旋转阀开始旋转起计时 2min）；③3%H2O2室温孵育 5～10min，PBS 冲洗，2min×3次；④5%～10%正常血清封闭，室温孵育10min。倾去血清，滴加TRAF2，抗体稀释浓度为1：20，4℃过夜；PBS冲洗，2min×3次；⑤滴加生物素标记二抗工作液，37℃孵育 10～20min； PBS冲洗，2min×3次；⑥滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育 10～20min；PBS冲洗，2min×3次；⑦DAB 显色剂显色；⑧自来水充分冲洗，复染、脱水透明、封片。PBS代替一抗作阴性对照。结果判定：光镜下观察细胞着色情况，蛋白定位于细胞胞浆内，阳性细胞胞浆呈棕黄色表达，结构清晰，着色明显高于背景。每张切片随机选择5个细支气管，Image-pro Plus 5.1免疫组化图像分析系统对阳性细胞进行灰度扫描，取其平均值代表该片的光密度值（OD值）。

2 结果

2.1 热毒宁对肺组织病理学的影响 HE染色显示，对照组肺组织结构完整，支气管腔规则，黏膜上皮完整，较少炎症细胞浸润。哮喘组肺内支气管及血管周围见大量炎性细胞浸润、黏液腺增生、气道上皮断裂和脱落、黏液栓形成等表现。热毒宁组炎性细胞数目较哮喘组明显减少，黏膜上皮增生不明显，支气管腔见较少的炎性分泌物，黏液腺增生不明显，未见黏液栓的形成，见图1（封三）。

2.2 热毒宁对肺组织TRAF2表达的影响 免疫组化结果显示，阳性细胞的胞浆呈棕黄色表达，主要表达于气道上皮细胞和炎症细胞，而肺组织中却较少表达。哮喘组支气管壁TRAF2的光密度值显著高于对照组（P＜0.01）；热毒宁组支气管壁TRAF2的光密度值与哮喘组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），但仍显著性高于对照组（P＜0.01），见表1、图 2（封三）。

表1 三组大鼠支气管壁TRAF2表达水平比较（±s）

表1 三组大鼠支气管壁TRAF2表达水平比较（±s）

注：与对照组比较，△P＜0.01

组 别 n/只 TRAF2（OD值）对照组 9 0.220±0.057哮喘组 9 0.317±0.041△热毒宁组 9 0.291±0.019△

3 讨论

中药是我国的传统医药，有着丰富的临床治疗经验。常作为一种辅助性药物用于哮喘和咳嗽变异性哮喘的治疗[9-10]，不仅能调节哮喘时的Th1/Th2失衡[11]，还能下调 TNF-α、IgE 等炎症因子[12]。热毒宁注射液主要成分为青蒿、金银花、栀子，具有疏风解表、清热解毒的作用。青蒿辛、苦、寒，辛以解表、寒以清热是解表清热、宣郁散邪之良药。研究表明，青蒿具有免疫抑制和细胞免疫促进作用。金银花具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫、解热抗炎、利胆、保肝、降脂等多种药理作用。栀子性寒、味苦、无毒，具有泻火除烦、清热利湿、凉血散瘀的功效。本研究发现，热毒宁组肺组织支气管黏膜上皮增生、支气管腔炎性分泌物、黏液腺增生和黏液栓的病理改变较哮喘组显著性减轻，尤其是炎性细胞数目较哮喘组明显减少，提示热毒宁注射液具有抗炎作用，能够抑制哮喘的气道炎症，为哮喘治疗提供了新的前景。

TRAFs是TNF受体超家族和IL-1R/TLR超家族信号传导通路的重要成分，TNF信号传导中，TRAF2作为接头蛋白和调控因子在几乎所有分支通路中起作用，在调节TNF-R1介导的NF-κB和JNK激活过程中起重要作用。TRAF在天然免疫和获得性免疫中都起重要作用，是细胞凋亡和细胞应激反应的重要调节因子[13]。TRAF不仅能增强TNFR诱导的炎症因子的产生，而且能增强TNFR1-TNFR2的协同作用[14]，还与炎症细胞的分化有关[15]。TRAF2是TRAF家族的经典成员，几乎在所有组织中转录，是表达最为广泛的TRAF家族成员。TRAF2能与TNF受体家族中的大多数成员相互作用，并在TNF-R1介导的NF-κB和JNK的激活过程中起作用，对多种生理过程十分重要，如细胞生长、死亡、发育、癌基因的表达、免疫和感染等[16]。

本研究结果显示，阳性细胞的胞浆呈棕黄色表达，提示TRAF2表达部位在细胞浆。它主要表达于气道上皮细胞和炎症细胞中，而肺组织和支气管平滑肌中却较少表达，提示它可能主要是通过气道上皮细胞和炎症细胞起作用。而TRAF1主要表达在支气管平滑肌细胞，可能是通过支气管平滑肌细胞的途经参与哮喘气道高反应性[17]。本研究同时发现，哮喘组支气管壁TRAF2的光密度值显著高于对照组，提示TRAF2可能与哮喘的气道炎症有关。相似的研究[18]也发现，在OVA诱导的哮喘小鼠模型中，支气管肺泡灌洗液中炎症细胞（嗜酸细胞、中性粒细胞、淋巴细胞）、Th2细胞因子和气道高反应性显著增加，而TRAF1缺失的小鼠则没有上述改变，认为TRAF1可能是促进哮喘炎症的一个细胞因子。上述表明，TRAF家族在哮喘的发病中可能起了致炎的作用，抑制或阻断TRAF的信号通路可能是治疗哮喘另一个有效的途经。本研究还发现，热毒宁组支气管壁TRAF2的光密度值与哮喘组相比差异无统计学意义，仍显著性高于对照组。提示热毒宁抑制哮喘气道炎症可能不是通过TRAF2途径，或其量效关系还没有发现。

上述结果表明，哮喘大鼠TRAF2的表达水平增强，它可能参与了哮喘的气道炎症过程。热毒宁能减轻哮喘大鼠气道炎症，可能不是通过TRAF2途径，其机制尚有待于进一步研究。

[1]中华医学会儿科学分会呼吸学组《中华儿科杂志》编辑委员会.儿童支气管哮喘诊断与防治指南[J].中华儿科杂志,2008，16（10）：745-753.

[2]陈灵红.热毒宁注射液治疗小儿急性上呼吸道感染102例[J].浙江中西医结合杂志，2008，18（6）：391.

[3]黄承吨.清热解毒法治疗慢性支气管炎急性发作的疗效观察[J].中国医药指南，2010，8（25）：86-87.

[4]刘红菊，陶晓南，辛建宝，等.中药热毒宁对急性肺损伤兔肺内致炎因子的影响[J].中国新药与临床杂志,2007，26（6）：446-449.

[5]刘红菊，张建初，张劲农，等.热毒宁注射液对兔急性肺损伤的防治作用[J].华中科技大学学报（医学版），2008，37（5）：610-613.

[6]Desai D,Brightling C.TNF-alphaantagonism in severe asthma[J].Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov，2010，4（3）:193-200.

[7]李昌崇,童夏生,阮正英,等.中性粒细胞弹性蛋白酶和IL-8在大鼠哮喘中的作用及地塞米松调控[J].中华微生物学和免疫学杂志,2005,25（9）:737-741.

[8]童夏生,罗冬娇,叶斌,等.CXC类趋化因子GROα、ENA-78及NAP-2在大鼠哮喘中的表达及意义[J].中华微生物学与免疫学杂志，2009,29（9）:778-781.

[9]韩振新.GINA方案加中药贴敷治疗儿童支气管哮喘56例效果观察[J].南通大学学报（医学版），2010，30（6）：460。

[10]张太华.中药内服外用治疗咳嗽变异性哮喘28例[J].河南中医学院学报，2009，24（141）：78.

[11]黎媛，曾垂秀，周远大.中药对过敏性哮喘大鼠模型Thl/Th2型细胞因子的影响[J].细胞与分子免疫学杂志，2009，25（1）：1056-1057，1060.

[12]熊维，郑培榆，张渝，等.中药对哮喘大鼠IL-18mRNA和TNF-αmRNA表达及IgE含量的影响[J].第四军医大学学报，2009，30（8）：753-756.

[13]Wang PH，Wan DH，Gu ZH，et al.Litopenaeus vannamei tumor necrosis factor receptor-associated factor 6（TRAF6）responds to Vibrio alginolyticus and white spot syndrome virus（WSSV）infection and activates antimicrobial peptide genes[J].Dev Comp Immunol，2011，35（1）:105-114.

[14]Wicovsky A，Henkler F，Salzmann S,et al.Tumor necrosis factor receptor-associated factor-1 enhances proinflammatory TNF receptor-2 signaling and modifies TNFR1-TNFR2 cooperation[J].Oncogene，2009，28（15）:1769-1781.

[15]Dupoux A，Cartier J，Cathelin S，et al.cIAP1-dependent TRAF2 degradation，regulates the differentiation ofmonocytes into macrophages and their response to CD40 ligand[J].Blood，2009，113（1）:175-185.

[16]Chen G,Goeddel DV.TNF-R1 signaling:a beautiful pathway[J].Science，2002，296（5573）:1634-1635.

[17]Amrani Y，Chen H，Panettieri RA.Activation of tumor necrosis factor receptor 1 in airway smooth muscle:a potential pathway that modulates bronchial hyper responsiveness in asthma[J].Respir Res，2000，1（1）:49-53.

[18]Oyoshi MK，Bryce P，Goya S，et al.TNF receptor-associated factor 1 expressed in resident lung cells is required for the development of allergic lung inflammation[J].J Immunol，2008，180（3）:1878-1885.