芹菜籽提取物抑制卵巢癌细胞SKOV-3生长的机制研究

张 伟 李福荣

(泰山医学院，山东 泰安 271016)

芹菜籽，为伞形科植物芹菜的成熟果实，取自芹菜小小的花朵中，颜色多为棕褐色或深棕色，含桉油醇、磷甲氧基酚、伞花内酯、芹菜素、亚麻酸、挥发性油脂、黄酮、硼、矿物质(钙、镁、钠、锌等)。维吾尔医生认为芹菜籽有散气、消肿、利尿、开通阻滞、降血压等功效，在维吾尔药中主要用于治疗高血压、关节炎、类风湿性关节炎、气滞性子宫炎、腹水、肾脏等疾病［1］。有报道证实芹菜籽有强大的抗癌作用，对多种癌细胞均具有杀伤作用［2－3］。动物实验表明［4－5］，芹菜籽油中所含有的柠檬烯成分具有消炎、抗氧化、利胆等作用，而且是强抗癌物质，可以预防和治疗化学致癌物诱导的胃癌、结肠癌、肺癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌等［6－7］。近年来天然药物的抗癌作用研究成为热点，本实验就芹菜籽粗提物对卵巢癌细胞SKOV-3干预作用的机制进行了实验研究，旨在为芹菜籽应用于临床治疗提供实验资料和理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料 卵巢癌细胞SKOV-3购于中科院上海细胞所，培养瓶，培养板(Costar公司)，RPMI-1640细胞培养液(Gibic公司)，10%新生牛血清(杭州四季青公司)，流式细胞术凋亡检测 Annexin V-FITC双染色及细胞周期PI检测试剂盒(南京凯基生物技术有限公司)，二甲基亚砜(DMSO)等。

1．2 方法

1．2．1 芹菜籽提取物(CSE)提取方法 应用CO2超临界萃取法(SFE-CO2)提取芹菜籽有效成分，芹菜籽300 g烘干、粉碎、过筛(60目)，投入萃取釜中，先后采用一级萃取、二级分离的阶梯法萃取。设定萃取器压力25 MPa，温度45℃，萃取时间为2 h，再进入冷冻、高压泵、再冷冻循环。萃取得到半固体深褐色油状物，称重67 g。

1．2．2 MTT检测CSE对细胞生长的抑制作用 卵巢癌细胞SKOV-3传代接种于含10%新生牛血清的RPMI-1640培养瓶中，置于37℃含5%CO2的细胞培养箱中，2～3天传代一次，取对数期细胞，按密度0．4×105/ml接种于96孔培养板，无血清培养24 h。分别加入终浓度为 5，0．5，0．05 μg/L CSE高、中、低剂量组。干预12 h后加入MTT溶液，4 h后加入DMSO溶液，10 min后在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。

1．2．3 流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡 上述分组细胞经CSE干预处理12 h后收集细胞，设定细胞密度为1×105/ml，PBS洗2次，吸入490 μl细胞悬液，加入5 μl Annexin V-FITC及 5 μl PI(浓度250 μg/ml)，混匀避光温育10 min，立即上流式细胞仪分析(Ex=488 nm;Em=530 nm)检测凋亡率，光源为488 nm氩离子激光器，FITC被激发后发射绿色荧光，PI散出红色荧光。

1．2．4 流式细胞术PI染色检测细胞周期 上述分组细胞经CSE干预处理12 h后收集细胞，设定细胞密度为2×106/ml，70%冷乙醇缓慢加入固定细胞过夜，冷 PBS 洗2 次，加入 PI 5 μl，RNase 50 μg/ml，0．1%Triton X-100，0．1 mmol/L EDTA(Na)2。置黑暗处反应1 h后上流式细胞仪检测(激发波长488 nm，氢离子激光)，以multcycle DNA分析软件包分析细胞周期。

1．2．5 统计学分析 实验数据以均数±标准差表示。采用SPSS 13．0软件包对实验数据进行oneway ANOVA分析及LSD两两比较。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 应用MTT方法观察分析芹菜籽提取物对卵巢癌细胞SKOV-3的增殖活性的抑制作用 应用三个浓度的CSE处理后，细胞吸光度OD值低于空白对照组(P＜0．01)，细胞增殖活性显著降低，且此效应呈浓度依赖性(P ＜0．01，表1)。

表1 MTT检测CSE对细胞活性的影响(±s，n=8)

表1 MTT检测CSE对细胞活性的影响(±s，n=8)

注:＊＊P ＜0．01 vs对照组，*P ＜0．01 vs对照组，#P ＜0．01 vs低剂量组。

分组 MTT(OD值)1．605 ±0．157 CSE(5 μg/L) 0．329 ±0．012＊＊CSE(0．5 μg/L) 1．437 ±0．088*#CSE(0．05 μg/L) 1．645 ±0．108对照组#

2．2 CSE对卵巢癌细胞SKOV-3细胞周期的影响

DNA倍体分析结果显示CSE可促进癌细胞细胞周期停滞。对各组G0/G1、S、G2/M各期细胞分布比例分析，与未加药物的空白对照组相比，各CSE处理组S期细胞百分比降低(P＜0．01);而G0/G1期细胞比例显著增高(P＜0．01)，具体结果见流式细胞仪PI染色DNA倍体分析结果(图1)，及统计分析结果(图2)。

图1 流式细胞仪PI染色DNA倍体分析结果

图2 CSE对细胞周期分布的影响

2．3 CSE对卵巢癌细胞SKOV-3凋亡的影响

按照Annexin V-FITC/PI双荧光染色结果的判定标准，对实验散点图相应数据进行统计学分析，结果显示，与空白对照组相比，各CSE处理组的早期与晚期凋亡率之和显著增加(P＜0．01)，且药物三个浓度的抑制作用呈现剂量依赖性的增加效应，有统计学意义(P ＜0．01，图3)。

图3 CSE对细胞凋亡的影响

3 讨论

近年来，随着国内外对于抗肿瘤药物研究的重视加强，越来越多的抗肿瘤药物被研究和开发出来，由于化学类药物一定的毒副作用限制了它们的广泛使用和疗效，所以寻找安全无毒的抗癌中草药显得尤为重要。我国的中医中药研究历史悠久，作为有着丰富的中药资源的国家，我们在中药以及有效成分对于肿瘤作用及其机制上已经有了大量的研究。既往已有研究显示，有很多的中药都存在着不同程度的抗癌作用，例如钱士辉等［8］的抗肿瘤实验研究结果显示，陈皮提取物的剂量在 2．5，5．0，10．0 mg/(kg·d)时对小鼠移植性肿瘤Heps的抑制率分别达到39．38%，54．42%，49．56%。拓扑异构酶抑制剂(RFS-2000)可以有效治疗胰腺癌［9］，同时它又是从中国喜树中所获得的一种有效成分。中药单体淫羊藿苷通过下调白血病细胞HL260端粒酶的活性来达到抗肿瘤作用，并且具有一定的时间－效应关系，作用随着时间的延长抗癌作用加强［10］。

细胞凋亡在生物的发育、疾病的发生发展以及肿瘤的治疗中有着重要的作用。现已明确，大多数抗肿瘤药物都可诱导肿瘤细胞凋亡，并且其效能与肿瘤细胞在药物诱导下发生凋亡的内在活性有关［11］。细胞周期与细胞增殖密切相关，细胞周期的长短取决于G0/G1期，S期阻滞可使细胞周期延长，增殖速度减慢。细胞通过两个限制点(G1/S期限制点和G2/M期限制点)保证细胞的忠实复制［12］。药物引起肿瘤细胞周期阻滞后，修复成功的细胞向分化方面发展，继续进入增殖周期，不能修复者则进入凋亡途径。

本研究采用MTT计数细胞吸光度、检测芹菜籽提取物具有诱导卵巢癌细胞SKOV-3的作用，并证实其作用具有剂量依赖性效应。流式细胞仪检测证明药物干预后癌细胞凋亡增加，细胞周期结果显示，S期细胞数目减少。其机制可能出现细胞周期在G0/G1→S期的阻滞，生长发育停滞并进而导致细胞凋亡，但是其分子机制尚不明确，需要进一步的研究。随着人们对芹菜籽挥发油研究的不断深化，芹菜籽挥发油的应用范围也必将进一步扩大，本实验为芹菜籽的进一步深入研究提供了实验资料和理论依据。

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