金雀异黄酮预适应对大鼠小脑浦肯野细胞缺血再灌注损伤的保护作用

赵士弟 黄 丽 姜之全 姜丽娜 王小娇 陈前芬 (蚌埠医学院病理生理学教研室，安徽 蚌埠 233030)

药物预处理是否具有脑保护作用，报道并不多见。金雀异黄酮(GEN)是大豆异黄酮的主要活性成分，为一种选择性雌激素受体调节剂(SERM)、抗氧化剂和酪氨酸蛋白激酶抑制剂。GEN对肿瘤、骨质疏松、心血管等疾病的防治作用已有报道〔1〕，且GEN可促进脑缺血组织的海马神经的再生〔2〕。本实验观察GEN对脑缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用。本实验选择观察小脑浦肯野神经元缺血再灌注损伤的存活率是因其对缺血敏感，缺血性损伤和死亡在小脑脑片上容易识别。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与设备 SD大鼠(蚌埠医学院实验动物中心提供)，Genistein(Sigma公司)，CK(南京建成生物工程研究所)，Tris-GTP、EGTA、Mg2+-ATP、HEPES(Sigma 公司)、振荡切片机(美国VIBRATOME公司)，721分光光度计(上海湖光科学仪器公司)。

1.2 溶液配制 人工脑脊液(ACSF)Ⅰ组成(mmol/L):124 NaCl，3 KCl，1.3 NaH2PO4，26 NaHCO3，10 dextrose，5 HEPES，0.5 CaCl2和4 MgSO4，pH 7.35～7.45(1 mol/L NaOH 调节pH)。ACSFⅡ组成(mmol/L):124 NaCl，3 KCl，1.3 NaH2PO4，26 NaHCO3，10 dextrose，5 HEPES，2.4 CaCl2和 1.3 MgSO4，pH7.35～7.45(1 mol/L NaOH调节pH)。

1.3 脑片的制备 取出生后17～21 d SD大鼠，放入4 L钟形玻璃容器，容器内放入2 ml异氟烷，行异氟烷吸入麻醉。刀片断头，取出小脑，去除脑干及小脑半球，将小脑蚓部放入充分氧合(通95%O2和5%CO2)的冰水混合的ACSFⅠ中。将小脑蚓部切成400 μm脑片，放入充分氧合(通95%O2和5%CO2)的ACSFⅡ，在25℃条件下孵育1 h以恢复细胞功能。

1.4 体外缺血再灌注模型制备〔3〕将小脑脑片转移至40 ml无氧(通95%N2和5%CO230 min)无糖的ACSF培养液中培养20 min模拟缺血，再转移至充分氧合的ACSFⅡ培养液中培养4 h，用来模拟再灌注，使OGD造成的细胞损伤和死亡更加明显。

1.5 实验分组 ①正常对照组:以充分氧合的ACSFⅡ培养脑片6 h;②缺血再灌(I/R)组:先以充分氧合的ACSFⅡ培养脑片100 min，再转移至OGD液20 min，最后转移至充分氧合的ACSFⅡ培养即再灌4 h;③GEN高、中、低剂量组:先以充分氧合的ACSFⅡ培养脑片60 min，后分别转至含GEN 200、100和50 mol/L的ACSFⅡ培养脑片20 min，再转至无GEN的ACSFⅡ培养脑片20 min后转移至OGD液20 min，最后再灌4 h;④尼莫地平组:先以充分氧合的ACSFⅡ培养脑片100 min，再转移至含尼莫地平10 mol/L OGD液20 min，最后转移至充分氧合的ACSFⅡ培养即再灌4 h。

1.6 形态学实验 再灌注后的脑片置于4%的甲醛溶液4℃保存24 h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，取脑片内部组织做病理切片(距边缘约100 μm组织)以排除在脑片制备中直接受损的区域并进行HE染色，检测未受损浦肯野细胞的百分比即存活率。有下列特征之一则视为受损:肿胀、空泡化或细胞固缩核深染。脑片的每个区域至少有50个浦肯野细胞被计数或3个区域计数的总数超过150个浦肯野细胞。

1.7 小脑组织CK活力测定 按照试剂盒说明书操作。

1.8 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析。实验结果以±s表示，两组间比较用t检验，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 糖氧剥夺和恢复糖氧灌流诱导浦肯野细胞损伤 见图1。

图1 GEN对浦肯野细胞I/R损伤病理学的影响(HE，×400)

2.2 GEN预适应20 min后糖氧剥夺和恢复糖氧灌流浦肯野细胞的存活率变化 与正常对照组相比，I/R组浦肯野细胞的存活率明显降低(P＜0.0005)。与I/R组比较，GEN 200和100 mmol/L预适应组浦肯野细胞的存活率明显增加(P＜0.005和P＜0.01)，GEN 50 mmol/L预适应组浦肯野细胞的存活率略有升高趋势，但差异无显著性。见表1。

表1 GEN对浦肯野细胞存活率BCK活性的影响(n=8，±s)

表1 GEN对浦肯野细胞存活率BCK活性的影响(n=8，±s)

与I/R组比较:1)P＜0.01，2)P＜0.005，3)P＜0.001;与正常对照组比较:4)P＜0.0005

组别 剂量(mmol/L)存活率(%) CK(U/mg)正常对照组85±7 21.65±3.24 I/R组 0 31±74) 8.97±1.854)GEN组 50 35±9 10.03±2.39100 45±111) 12.47±2.681)200 59±92) 16.04±3.243)尼莫地平 10 46±101) 13.03±2.821)0

2.3 GEN预适应20 min后糖氧剥夺和恢复糖氧灌流小脑组织CK活性变化 与正常对照组相比，I/R组小脑组织CK活性明显升高(P＜0.0005)。与 I/R组比较，GEN 200和100 mmol/L预适应组小脑组织CK活性明显降低(P＜0.001或P＜0.01)，GEN 50 mmol/L预适应组小脑组织CK活性略有降低趋势，但差异无显著性。见表1。

3 讨论

IPC是通过调动机体内源性物质如腺苷、缓激肽、降钙素基因相关肽、PGI2、NO 等来提高缺血的耐受性〔4，5〕。目前，预适应的方法不再局限于脑缺血，而是涵盖了许多“亚毒性”的侵害性物质或措施。药理性预适应是根据IPC机制，通过药物模拟或诱导机体内源性物质而起到预适应的作用〔6〕。

有关脑缺血再灌注损伤的模型较多，有在体的动物模型，也有离体的模型。OGD模型是一种较好的离体脑缺血模型，OGD模型是通过移除培养液中的葡萄糖和氧气模拟缺血，再恢复到正常的培养条件模拟再灌注。该模型所得资料类似于采用其他在体或离体缺血模型的实验资料，并且在实验研究中的应用已得到认可。与在体的脑缺血再灌注损伤的模型相比，OGD模型便于控制和改变细胞外环境，可选择特定类型的细胞，并能在体外研究单个细胞的胞内状况，因此，这种模型在神经保护机制方面的研究是常用的。

细胞内钙超载与自由基损害是脑缺血再灌注损伤的重要发病机制。脑缺血再灌注后，大量氧自由基产生，导致膜脂质过氧化，细胞膜的结构和完整性遭到破坏，最终使细胞膜的通透性增加，胞浆酶被释放到细胞间隙，使脑组织中的酶活性降低。已知脑组织中广泛存在CK，有实验及临床观察证明脑缺血时脑组织CK释放增加。因此，检测脑组织中CK的含量变化可准确反映脑组织细胞受损的程度。本实验结果提示GEN预适应可以减少脑缺血坏死的程度，对小脑浦肯野细胞缺血再灌注有保护作用。大量的研究表明，GEN类物质通过提高体内酶促抗氧化防御系统能力，清除氧自由基保护缺血再灌注的脑组织〔7〕。本实验结果说明GEN也是通过提高体内酶促抗氧化防御系统能力，清除氧自由基来保护缺血再灌注的小脑浦肯野细胞。脑缺血后由于ATP生成减少，引发胞外大量的Ca2+内流，同时激活细胞内Ca2+库的释放，导致细胞内游离Ca2+超载，激活了各种降解酶如DNA酶、钙调磷酸酶、蛋白酶和磷脂酶，同时过量Ca2+沉积于线粒体，使线粒体氧化磷酸化失耦联进一步加重，膜电位丧失，呼吸链解体，导致细胞能量的严重丢失，同时致使O2经单电子还原生成超氧阴离子增多，产生的大量自由基，引起DNA、蛋白质和磷脂降解，细胞代谢、结构与功能多方面的异常改变，神经细胞逐步死亡〔8〕。本实验表明GE N可能通过抑制细胞钙通道，减轻细胞内钙超载，进而减轻I/R损伤。近来研究也表明，大豆异黄酮可能通过抑制电压依赖性钙通道从而影响心肌细胞动作电位时程〔9〕。

1 龙 军，张 良，袁冬平，等.大豆异黄酮对脑缺血再灌注大鼠海马神经再生的影响〔J〕.南京中医药大学学报，2011;27(1):49-55.

2 Lim YJ，Zheng S，Zuo Z.Morphine preconditions purkinje cells against cell death under in vitro simulated ischemia-reperfusion conditions〔J〕.Anesthesiology，2004;100(3):562-8.

3 Zhao S，Chen N，Yang Z，et al.Ischemia deteriorates the spike encoding of rat cerebellar Purkinje cells by raising intracellular Ca2+〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2008;366(2):401-7.

4 Pasupathy S，Homer-Vanniasinkam S.Ischaemic preconditioning protects against ischaemia/reperfusion injury:emerging concepts〔J〕.Eur J Vasc Endovasc Surg，2005;29(2):106-15.

5 Arrell DK，Elliott ST，Kane LA，et al.Proteomic analysis of pharmacological preconditioning:novel protein targets converge to mitochondrial metabolism pathways〔J〕.Circ Res，2006;99(7):706-14.6 熊利泽，路志红.脑缺血预处理研究进展〔J〕.第四军医大学学报，2002;23(15):1347-8.

7 邢 岩，田庆伟，王永明，等.大豆异黄酮对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用〔J〕.营养学报，2006;28(1):85-6.

8 李智慧，田庆伟，邢 岩，等.大豆异黄酮对脑缺血再灌注模型小鼠抗氧化系统的影响〔J〕.天津医科大学学报，2005;11(1):45-7.

9 马丽娟，赵春燕，张文杰，等.大豆异黄酮对培养心肌细胞钙电流和动作电位的影响〔J〕.中国老年学杂志，2006;26(2):206-8.