慢性高眼压致兔视神经及视功能的损伤

魏 文 李 运 杨晓冉 巩 磊 (山东大学附属省立医院眼科中心，山东 济南 25002)

青光眼是严重危害视神经视觉功能的常见的眼病之一，目前临床主要根据眼压、视乳头的凹陷性萎缩、特征性视野缺损来进行诊断。高眼压是其最主要的危险因素，临床上往往是在视野缺损或视乳头病理性改变之后才做出明确的诊断和治疗，而此时病程已非早期，而且青光眼视功能损害是不可逆性，因此对青光眼的早期诊断、及时治疗显得尤为重要。我们建立慢性高眼压动物模型，通过观察眼压在中度升高的情况下兔的眼底杯/盘面积比(C/DAR值)、视觉电生理a，b，Ops波的振幅及视网膜神经节细胞和神经纤维数量的病理改变，研究视网膜结构和视功能的损伤，为青光眼的早期干预提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康新西兰大白兔20只40眼(由山东省农科院兔厂提供)，体重在2～2.5 kg，雌雄不限，经裂隙灯检查证实无眼前节病变，测量眼压值均在正常范围内。

1.2 慢性高眼压动物模型的建立与分组 5%戊巴比妥钠1 ml/kg经耳缘静脉推注麻醉，肌肉注射15 mg/kg以维持麻醉。1%地卡因表面麻醉，经角巩膜缘处用1 ml空针做隧道刺入前房，抽取房水0.2 ml后，每只兔随机一眼为高眼压组(20眼)前房内注入卡波姆(上海申兴制药厂)0.2 ml，后缓慢拔出空针，穿刺口自动封闭。另一眼为正常组(20眼)仅作前房穿刺，不做前房内注入卡波姆。

1.3 术后观察

1.3.1 眼压 建模后，每日固定时间由同一人测量眼压，如测眼压连续两日低于30 mmHg，即行前房内重复注射卡波姆。

1.3.2 眼底照相 分别于建模前及后7、14、21、28 d在全麻下用眼底照相系统(日本TOPCON TRC.50I-X)行眼底照相。照相结果采用photoshop 7.0软件计算C/DAR值。

1.3.3 闪光视网膜电图(F-ERG)检查方法及条件 分别于建模前及后7、14、21、28 d在全麻下检查 F-ERG。应用 UTASE3000眼电生理仪器(美国LKC科技公司)，按照国际临床视觉生理电生理学会制定的闪光ERG测试参数标准(ISCEV ERG)〔1〕设置参数，检查前充分散瞳，暗适应40 min。脱毛，麻醉，固定电极，在暗红光下将电极固定于两眼连线中点和同侧耳廓皮肤，分别作为参考电极和接地电极，眼表面麻醉后角膜接触电极放置于角膜表面。依次记录第一项暗视视杆细胞反应、第二项暗视视杆细胞-视锥细胞混合反应、第三项暗视振荡电位。明适应20 min后按上述步骤测量第四项明视单次闪光视锥细胞反应、第五项明视30 Hz闪烁光视锥细胞反应。取a波、b波、Ops波振幅为观察指标，每次每只眼测3次取平均值。

1.3.4 取材及病理标本制作 分别于术后7、14、21、28 d随机处死5只兔子，12点方位缝线标记，完整摘除眼球，自球后1 mm横断视神经，分别制成眼球及球后4 mm的视神经标本，置于10%的中性甲醛溶液中固定48 h后，常规乙醇梯度脱水，二甲苯透明、浸蜡，包埋，平行于眼球剖面通过视神经做6 μm连续切片6～9张，H-E染色，制成视网膜神经节细胞病理标本。视神经行横断面切片，3 μm连续切片3张，采用改良髓鞘染色法染色(丽春红-亮绿染色法)〔2〕，胶原纤维等结缔组织呈绿色，髓鞘及轴突呈紫红色。

1.3.5 阅片及图像分析 OlympusBX51显微镜下选取视盘周围5 mm内的视网膜标本〔3〕，置于400倍下进行观察拍照，用10×10目网格(1 mm2)计算10个方格中神经节细胞数目，每只眼计数3张切片，每张切片取3个视野，取平均值。视神经切片以10×100油镜细致观察，每例在不同位置采集3幅图片供分析。在Mias图像分析系统(分析软件由四川大学图像图形研究所研制)下打开图像，选择图像中髓鞘及轴突染色的紫红色为目标颜色，进行颜色分割，对计算机误判的区域进行人工清除。利用“目标计数”程序自动测量“目标数目”。并以n/mm2表示。

1.4 统计学处理 应用SPSS10.0软件进行配对资料t检验及组间两两比较的q(Newman-Keuls法)分析。

2 结果

2.1 眼压改变 建模后高眼压组眼压均大于30 mmHg，两组建模前比较无显著性差异(P＞0.05)。两组建模后各时间段比较均有显著性差异(P＜0.01)。见表1。

2.2 眼底照相

2.2.1 眼底照相改变 建模前兔眼底为粉红色，视乳头杯盘比约0.3。高眼压组建模后7 d，视乳头凹陷稍有限局性扩大。14 d时视乳头凹陷扩大，颜色变浅，血管出现轻微移位(图1)。21 d时视乳头凹陷明显扩大，乳头颜色变浅，血管呈明显的屈膝状。28 d时视乳头视盘面积明显扩大、色淡，血管明显屈膝、变细。对照组视乳头形态无改变。

2.2.2 C/DAR值改变的比较 两组建模前及建模后7 d时无统计学差异(P＞0.05);14 d时出现统计学差异(P＜0.05)。且随着时间的延长，差异越显著。见表1。

表1 眼压值和各组C/DAR值比较(mmHg， ± s，n=20)

表1 眼压值和各组C/DAR值比较(mmHg， ± s，n=20)

7 d 14 d 21 d 28 d高眼压组 16.38±3.73 33.28±6.07 35.19±8.11 36.75±7.63 34.27±9.82 0.315±0.029 0.385±0.028 0.475±组别 眼压建模前7 d 14 d 21 d 28 d C/DAR值建模前0.048 0.535±0.042 0.552±0.036正常组 15.81±2.72 16.79±2.91 16.53±3.17 15.86±2.86 17.46±3.39 0.324±0.030 0.319±0.034 0.327±0.039 0.311±0.052 0.320±0.028 P值 －0.01 0.01 0.01 0.01 0.4 0.06 0.04 0.02 0.01

2.3 标准ERG的改变

2.3.1 标准ERG a波振幅改变 两组建模前及后7，14 d比较无统计学差异(P＞0.05)，21 d时出现统计学差异(P＜0.05)。见表2。

2.3.2 标准ERG b波振幅改变 两组b波振幅于建模后7 d出现统计学差异(P＜0.05)，且随着时间的延长，差异越明显。见表3。

表2 两组a波振幅比较 (μV， ± s，n=20)

表2 两组a波振幅比较 (μV， ± s，n=20)

时点 正常组 高眼压组 P值建模前73.78±14.89 78.25±20.14 ＞0.057 d 78.40±16.11 60.03±16.17 0.3414 d 76.60±5.19 50.01±11.59 0.1521 d 72.20±6.19 38.40±12.24 0.0428 d 77.10±8.76 12.50±7.07 0.01

2.3.3 标准ERG的Ops波振幅改变 两组Ops总振幅在建模后7 d时即出现统计学差异(P＜0.05)，且随着时间的延长，差异愈明显。见表4。

2.4 组织病理学改变

2.4.1 视网膜组织切片观察 光镜下兔的正常视网膜结构所见与人相似，呈明显的结构分层。外核层细胞数最多，有3～5层;内核层细胞数较少，有2～4层;节细胞为单层，形态呈圆形或椭圆形，细胞核多偏于外侧，细胞分布均匀、紧密，形态、大小近似。可以清楚地看到内界膜、神经纤维层、神经节细胞层、内丛状层和内核层、外丛状层、外核层等各层次(图2)。建模后7 d:高眼压组神经节细胞排列稀疏，数目较正常组减少29.41%，但仍可见较多正常的神经节细胞，两组间节细胞数目比较有统计学差异(P＜0.05)。视神经纤维层明显变薄，偶见淋巴细胞浸润，内丛状层水肿明显，内核层细胞减少，外丛状层加厚，外核层细胞层数减少。14 d:高眼压组的神经节细胞都表现出明显的细胞泡状死亡，可见凋亡细胞，剩余神经节细胞形态出现明显异常，主要表现为胞质减少，细胞形态紊乱，神经节细胞计数较正常组下降43.59%(图2)，两者之间存在统计学差异(P＜0.05)。内核层细胞层几乎为单层，外丛状层水肿明显增厚，空泡连成片;内丛状层及外核层数减少。21 d:高眼压组RGCs数目下降51.19%，且两者之间存在统计学差异(P＜0.01)。神经纤维层、视神经节细胞层及内丛状层高度水肿增厚，层次不清，可见较多淋巴细胞浸润，外核层细胞排列稀疏。28 d:高眼压组几乎不能见到神经节细胞(较正常组下降73.77%)，两组比较有显著性差异(P＜0.01)。内核层细胞基本消失，外核层细胞排列更加稀疏。

表3 两组不同时间段b波振幅比较(μV， ± s，n=20)

表3 两组不同时间段b波振幅比较(μV， ± s，n=20)

与正常组各时间段内比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01

正常组建模前 102.7±19.6 110.7±23.1 220.3±19.5 216.5±22.时点 第一项高眼压组 正常组第二项高眼压组 正常组第四项高眼压组 正常组第五项高眼压组8 175.1±13.0 168.3±16.1 82.1±8.5 88.0±9.97 d 87.4±11.0 109.7±18.31) 159.3±25.7 199.0±13.61) 126.1±15.1 160.9±13.21) 66.1±15.1 82.1±8.21)14 d 57.6±16.3 98.8±19.61) 121.0±19.6 203.5±18.32) 89.6±10.1 165.1±13.22) 52.0±7.8 85.1±13.22)21 d 44.1±12.9 102.8±11.62) 78.3±21.3 214.1±25.52) 67.7±5.7 171.3±14.02) 40.2±6.3 83.8±5.72)28 d 20.8±14.6 105.0±10.32) 57.6±16.3 198.8±19.62) 42.2±16.3 169.0±14.92) 18.7±3.9 84.0±6.12)

2.4.2 视神经轴突光镜观察 正常视神经横切面视神经纤维排列紧密，纤维间质无水肿和空泡变性，基质均匀红染;神经胶质细胞形态正常，分布均匀，排列整齐。建模后7 d:高眼压组视神经纤维排列稍疏松，数目减少，纤维间质空泡样变性较多，水肿加重;胶质细胞形态基本正常，伴轻度紊乱、增生;可见少量条索样增生。14 d:高眼压组视神经纤维排列紊乱，数目减少，纤维间质融合的空泡样变性增多，水肿加重;胶质神经细胞体积大小不一，数目减少，排列不均匀;可见少量淋巴细胞浸润(图3)。21 d:高眼压组视神经纤维排列失去规律，数目减少，纤维间质空泡样变性大片融合，水肿进一步加重;胶质神经细胞体积大小不一，数目继续减少;可见大片漩涡状增生，较多成纤维细胞。可见大量淋巴细胞浸润。28 d:高眼压组视神经纤维数目减少严重减少，大片纤维间质空泡样变性融合及水肿;胶质神经细胞罕见;可见较多团状纤维增生，成纤维细胞。淋巴细胞浸润。视神经轴突定量图像分析两组视神经纤维数目自建模后7 d时即存在显著统计学差异。见表5。

表4 两组不同时间段Ops波振幅比较(μV， ± s，n=20)

表4 两组不同时间段Ops波振幅比较(μV， ± s，n=20)

正常组 高眼压组 P值建模前97.50±9.61 100.25±12.567 d 98.4±16.11 72.09±8.21 0.0214 d 97.6±5.19 63.03±5.71 0.0121 d 96.2±6.19 43.70±8.79 0.0028 d 97.10±8.76 16.65±3.46 0.00

表5 各组视神经节细胞计数(个/10 mm2)和视神经纤维计数(根/1 mm2， ± s，n=20)

表5 各组视神经节细胞计数(个/10 mm2)和视神经纤维计数(根/1 mm2， ± s，n=20)

组别 视神经节细胞视神经纤维98 845±659.8正常组 336.21±22.56341.12±27.13333.46±32.15318.91±26.2532962±915.2 32885±901.8 33127±878.3 32629±715.2减少率(%) 29.42 43.59 57.19 73.77 52.43 70.41 80.01 97.41 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.017 d 14 d 21 d 28 d高眼压组 237.31±35.67192.44±40.36142.74±36.38 83.65±44.1316271±1019.39 732±810.0 6597±786.7 d 14 d 21 d 28 d

减少率=100%－高眼压组剩余视神经节细胞数目/正常对照组视神经节细胞数目%

图1 建模前和建模后14 d眼底照相

图2 正常视网膜和高眼压14 d神经节细胞(×100)

图3 正常视神经和建模后14 d视神经轴突(×100)

3 讨论

青光眼时，眼球随着高眼压的持续存在，视网膜缺血缺氧的时间延长，节细胞缺血受损，其轴突构成的视神经损伤、变性〔4，5〕。青光眼视功能损害的病理学基础是视网膜神经节细胞的进行性凋亡及视神经纤维的丧失。随着高眼压持续时间的延长，视网膜光感受器的数量减少，内核层、外核层和丛状层排列发生紊乱，神经节细胞凋亡和神经纤维缺失的情况更加严重〔6，7〕。本研究病理切片结果显示随着高眼压状态的持续视网膜变薄，主要表现在神经节细胞层、神经纤维层，视网膜神经节细胞胞质减少、细胞水肿变形、最终细胞核固缩，节细胞凋亡;视神经纤维排列紊乱，间质空泡样变性，淋巴细胞浸润，胶质细胞增生最终凋亡，视神经纤维数目减少率明显增加。最终内核层及外核层也受累及;与他学者的研究比较基本相同。

随着高眼压持续时间的延长，视神经节细胞及其轴突呈进行性的损伤变性，在临床上表现为C/DAR的扩大及视乳头凹陷性萎缩。本实验中兔眼底照相可见视乳头凹陷加深，颜色变淡;盘沿变窄，变窄区域不对称;血管移位，甚至屈膝状。盘沿是视杯凹陷边缘与视盘边缘之间的环行区域，是视盘内相当于视神经纤维的组织〔8〕，视盘盘沿区域变窄或者形成切迹，是青光眼视盘形态学改变的典型特征，C/DAR是指视杯面积与视盘面积之比，能在一定程度上反映视神经纤维的数量。建模后高眼压组C/DAR值随着高眼压持续时间的延长与正常组C/DAR值比较逐渐增大且存在统计学差异，出现进行性的盘沿组织的丢失，有研究表明在检查出视野缺损之前，患者可能有多达40%的视神经纤维丧失〔9〕。另有研究认为，临床出现视网膜神经纤维层缺损时，组织病理学检查已有约50%的神经纤维缺损，而视野改变又往往晚于眼底神经改变约5年〔10〕。本实验结果与以上两位学者研究结果相似，甚至更严重。因此对于青光眼的防治，强调早发现早治疗。

在本研究中F-ERG中Ops波和b波的振幅最为敏感，于建模后7 d开始出现统计学差异，此时RGCs减少29.42%，神经纤维数目明显减少52.43%;a波则晚，在RGCs减少57.19%，视神经计数下降80.01%时才出现统计学改变。F-ERG是视网膜受到光刺激后在角膜记录到的一组视网膜电位变化。是反映视网膜功能状态的敏感指标，a波主要反映视网膜外核层光感受器的变化;b波反映视网膜内核层的电活动，可能来源于Muller细胞和双极细胞的跨膜电流〔11〕;Ops为叠加在b波上升支的3～5个小而快有节律子波的总和，也称为振荡点位，起源于视网膜内核层，是反映视网膜血液循环情况的一个敏感的、客观的、有效的指标。本实验结果表明持续性高眼压通过视网膜循环障碍，导致内核层功能下降，出现b波和Ops波振幅降低;最终为外核层受累，在21 d时a波振幅下降，出现统计学意义。其他学者的研究也表明〔12〕:随着眼球缺血程度的加重，视网膜振荡电位的振幅逐渐降低，潜伏期也延长，而且振荡电位的异常早于眼底视乳头的改变，对视网膜病变的早期诊断有重要价值。魏华〔13〕等对可疑开角型及早期开角型青光眼进行视觉电生理检查，结果在可疑青光眼组中有20%OPs波出现异常，提示在开角型青光眼病人在出现视野改变以前可能存在OPs异常。因此Ops和b波是反映视网膜功能状态的一个较敏感的指标，可以作为青光眼在早期诊断一项客观检查。

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