双向凝胶电泳和二维色谱技术检测大肠癌蛋白质谱的意义

李 峰 师庆红 张晓静 何成彦 赵丽纯 郭宏华 (吉林大学中日联谊医院，吉林 长春 30033)

大肠癌(colon cancer)是一种常见的消化道恶性肿瘤，死亡率在世界范围内居各种肿瘤的第三位，在西方居第二位，并且发病率和死亡率均有逐年上升的趋势〔1，2〕。大肠癌的发生和发展受到基因和环境等多种因素的影响，其病理机制复杂，从单一的基因突变和分子通道的变化难以全面理解大肠癌的发生机制。蛋白质组学是近年来发展起来的新兴学科，已经广泛应用于肿瘤研究的诸多方面。本文拟采用双向凝胶电泳和二维色谱技术分析Dukes B期大肠癌肿瘤与癌旁组织蛋白质的差异性，为大肠癌的早期诊断、生物学治疗寻找新的靶点。

1 材料与方法

1.1 组织标本 收集吉林大学中日联谊医院手术治疗的大肠癌患者18例，年龄49～78岁，其中男13人，女5人。在手术中获得的癌组织均是新鲜标本。所获得的癌旁正常组织均距离癌边缘10 cm之外、切缘正常组织，并且所取的正常组织标本均是在癌组织上端。标本离体后立即取材，生理盐水冲洗，放入液氮冷冻，－80℃保存。病人术前未接受任何治疗。取部分组织标本进行石蜡包埋、切片、HE常规染色，病理学检查证实组织类型，均是Dukes B腺癌。

1.2 主要试剂 载体两性电解质(Bio－Lyte 3－10)、IPG预制胶条(pH3～10，17 cm;pH5～8，17 cm)、矿物油、碘代乙酰胺(IAA)购自 Bio－Rad 公司(Hercules，CA，USA)。尿素、硫脲、精胺、蔗糖、甘油、三羟甲基氨基甲烷、3－〔(3－胆酰胺丙基)－二乙胺〕－丙磺酸(CHAPS)、丙烯酰胺、N，N，N′，N′－四甲基乙二胺(TMED)、甘氨酸、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴酚蓝、考马斯亮蓝G－250、苯甲基磺酰氟(PMSF)购于 Sigma 公司(St Louis，MO，USA)。低熔点琼脂糖、甲叉双丙烯酰胺、DTT、TPCK修饰的测序级胰酶购自Promega公司。过硫酸铵、碳酸氢氨、硝酸银、甲醛、乙醇、硫代硫酸钠、冰乙酸为国产分析纯。蛋白质定量试剂盒(RC DC Protein Assay Kit)购于Bio－Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 双向凝胶电泳技术和质谱技术鉴定大肠癌肿瘤与癌旁组织的差异蛋白质组 利用裂解缓冲液制备肿瘤组织与癌旁组织总蛋白，然后分别取肿瘤组织与癌旁组织总蛋白各1 mg，分别加入水化上样缓冲液至终体积300 μl。经pH 3～10等电聚焦分离和 SDS－PAGE电泳分离后，考马斯亮蓝染色，利用PDQUEST软件对电泳图像进行分析、剪切，建立匹配组并进行归一化处理。最后建立分析组，比较匹配点之间光吸收度的差异，获得肿瘤组织与癌旁组织总蛋白质的差异蛋白表达谱。

1.3.2 二维色谱技术和质谱技术鉴定大肠癌肿瘤与癌旁组织的差异蛋白质组 首先利用裂解缓冲液制备肿瘤组织总蛋白，然后分别用25 mmol/L NH4HCO3稀释，使尿素浓度低于2 mmol/L。经酶解后，将酶解产物进行二维液相色谱与质谱联用分析，得到肿瘤组织酶解混合物的多肽质谱数据。

2 结果

2.1 双向凝胶电泳技术和质谱技术

2.1.1 肿瘤组织与癌旁组织的差异蛋白表达谱 肿瘤组可分离(614±36)个蛋白点，癌旁组可分离(682±24)个蛋白点，匹配率为83.3%。其中肿瘤组织中21个蛋白质点的表达量有显著差异，其中有14个表达上调，有7个表达下调。

2.1.2 21个差异蛋白质点的质谱鉴定 直接切取21个差异蛋白质点，进行胶内酶切和肽段提取。然后在 MALDI－TOFTOF(DE STR，Applied Bio systems)质谱仪上进行肽质量指纹分析。将得到的数据用Mascot检索引擎在Swiss Prot数据库中进行检索，对21个蛋白质点进行鉴定。

2.2 二维色谱技术和质谱技术

2.2.1 肿瘤组织总蛋白酶解混合物二维色谱与质谱联用分析共鉴定29825个多肽序列，得到860个蛋白质的鉴定数据。

2.2.2 癌旁组织总蛋白的二维色谱与质谱联用分析 共鉴定了40388个多肽序列，共得到549个蛋白质的鉴定数据。

2.2.3 肿瘤与癌旁组织差异蛋白质的质谱分析 应用实验中每个蛋白的图谱评价其丰度。对于在不同样品中丰度发生变化的蛋白，其谱图数变化必须满足以下原则:①两个样品中谱图数的比值≥1;②两个样品中谱图数的差值≥72(平均每次实验差值为24)。为评价上述方法用于鉴别蛋白丰度变化的假阳性率，每个样品进行3次实验，然后比较结果，相应假阳性率为2.13%。将肿瘤与癌旁组织的蛋白质组分析的结果进行比对，依据上述评价原则及标准得到44个蛋白质具有显著差异，其中肿瘤组织中21个蛋白表达上调，23个蛋白表达下调。

2.3 双向凝胶电泳和二维色谱技术的对比 在大肠癌肿瘤组织与癌旁组织差异蛋白中有13个蛋白得到一致的鉴定结果，其中在肿瘤组织中表达上调的蛋白有7个，表达下调的蛋白有6个。见表1。

表1 肿瘤组织表达上调(A1～A7)和下调(B1～B6)的蛋白质鉴定结果

3 讨论

双向凝胶电泳和二维色谱一直是目前蛋白质组学的两大重要分离技术，双向凝胶电泳作为传统的技术手段由于其价格较低、易于操作等特性，一直被大多数实验室所采用〔3，4〕。但是一些特殊的蛋白质，如:强碱、强酸，过大、过小以及膜蛋白质，现在还不能用双向凝胶电泳方法进行分离，所以需要发展其他相关技术。而随着色谱技术的迅猛发展，发展可替代或补充双向凝胶电泳的新方法成为蛋白质组学研究技术最主要的目标。由于二维色谱质谱联用技术具有分析范围广、分析能力强、定性分析结果可靠、检测限低、分析时间快、自动化程度高等特点，所以液质联用技术成为分离、鉴定复杂混合物最有效的手段〔5，6〕。二维色谱(2D－LC)、二维毛细管电泳(2D－CE)、液相色谱－毛细管电泳(LC－CE)等新型分离技术都有补充和取代双向凝胶电泳之势。本实验利用双向凝胶电泳和二维色谱两大分离技术对Dukes B期大肠癌肿瘤组织与癌旁组织进行鉴定分析，两种方法所得到的结果有不一致的地方，主要原因为:①双向凝胶电泳方法测定的pH范围相对液质联用要窄，双向电泳等电聚焦分离的pH是3～7，而二维色谱方法测定的范围要比双向电泳广;②双向凝胶电泳在蛋白质提取的过程中必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和重复性的物质，比如核酸、脂类、多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG胶条，这样都会造成2－DE的失败，而二维色谱方法分析范围广、分析能力强、检测限低。但两者共同鉴定出的差异蛋白质对研究大肠癌的发病、转移及复发机制提供了依据和方向。

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2 Ahmed FE.Colon cancer:prevalence，screening，gene expression and mutation，and risk factors and assessment〔J〕.J Environ Sci Health，2003;21(2):65－131.

3 Kuroda N，Naras E，Miyazaki E，et al.Vinculin:its possible use as marker of 90 normal collecting ducts and renal neoplasms with collecting duct system phenotype〔J〕.Mo Pathol，2000;13(10):1109－14.

4 MacDonald N，Shivers W，Narum D，et al.Endostatin binds tropomyosin.Apotential modulator of the antitumor activity of endostatin〔J〕.J Biol Chem，2001;276(27):25190－6.

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6 Wilson ID，Plumb R，Granger J，et al.HPLC－MS－based methods for the study of metabonomics〔J〕.J Chrom，2005;817(1):67－76.