高浓度葡萄糖对Notch2信号通路及破骨细胞分化的影响

段 莉，林典岳*

（1.海南医学院附属医院口腔科，海南 海口 571101；2.海南医学院口腔医学院，海南 海口 571101）

破骨细胞来源于骨髓造血干细胞，由单个核前体细胞融合而成。已有研究提示，在破骨前体细胞向破骨细胞分化过程中，受到包括血糖浓度在内的多种微环境因素的调控[1]。同时，也有研究表明Notch信号是破骨细胞分化过程中重要信号通路之一[2-5]。目前，有关高糖浓度条件对破骨细胞分化及对Notch信号的影响还不清楚。因此，本研究旨在探讨高糖条件下，破骨细胞的分化以及Notch信号通路相关基因的表达情况。

1 材料与方法

1.1 试剂 α-MEM、特级胎牛血清，磷酸萘酚AS-MX，固红紫色LB磷酸盐(Sigma，美国)；RANKL，M-CSF(Peprotech，美国)；TRIzol试剂(Invitrogen，美国)；SYBR GREEN 试剂盒(Takara，日本)。

1.2 细胞培养 选用4周龄SD雄性大鼠，断颈处死，无菌条件下分离完整股骨、胫骨，暴露髓腔后用α-MEM培养基(含10%胎牛血清)冲洗骨髓腔数次至骨干发白为止。接种于10 cm培养皿，标准培养(饱和湿度、5%CO2、37℃)12 h 后收集非贴壁细胞，1 500 r/min，37℃离心5 min，弃上清，视为破骨前体细胞，加入M-CSF(20 ng/ml)和RANKL(30 ng/ml)诱导其向破骨细胞分化。

1.3 高浓度葡萄糖刺激 按照浓度依次增高的顺序，设置0 mmol/L，5 mmol/L，10 mmol/L，20 mmol/L，40 mmol/L五个葡萄糖梯度，同时设置相对应的甘露醇浓度，作为等渗对照。

1.4 抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色 将细胞磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，4%福尔马林固定液(Paraformal dehyde fixative)室温固定10 min，PBS洗2次，甲醇(Methyl alcohol)和丙酮(Aceton)混合液(1:1)固定 3～5 min，PBS洗2次[TRAP染色液配方：N,N-二甲基甲酰胺(N-N-Dimethylformamide)500 μl，磷酸萘酚 AS-MX(Naphtol AS-MX phosphate)5 mg，TRAP缓冲液×50 ml；固红紫色 LB 磷酸盐(Fast red violet LB salt)30 mg]，37℃10 min，双蒸水洗3次，光镜观察。多核(细胞核数目≥3个)且TRAP染色阳性的细胞视为破骨细胞。

1.5 RNA的提取、cDNA制备及实时定量PCR分析 用TRIzol试剂一步法抽提细胞总RNA，紫外分光光度仪测定RNA260/RNA280吸光度值以检测RNA样品的纯度和浓度。按Fermentas逆转录试剂盒操作进行RT-PCR[在 20 μl反应体系中含 200 U MMLV 逆转录酶，1×MMLV 缓冲液，20 U RNase，0.5 μg Oligo d(T)，2.5 mmol/L dNTP，1μg 总RNA模板]。cDNA合成在42℃进行60 min，70℃灭活5 min。实时定量PCR分析用SYBR Green试剂盒。利用Primer Express 2.0设计针对 Notch1、Notch2、Jagged1基因与β-actin引物如下：小鼠Notch1正义链5'-TCAATGCCGTGGATGACCTA-3'，反 义 链 5'-CCTTGTTGGCTCCGTTCTTC-3'；小鼠Notch2正义5'-CCCCTTG CCCTCTATGTACCA-3'，反 义 链 5'-GGTAGGTGGGAAAGCCACACT-3'；小鼠Jagged1正义链5'-CG GTGGCTGGGAAGGAA-3'，Jagged1 反义链5'-CTCGGGCCACACCAGAC-3'；β-actin 正义链 5'-TGAGA GGGAAATCGTGCGT-3'，反义链5'-GCTGGAAGGT GGACAGTGAG-3'。 利 用 2-ΔΔCT公 式 计 算 Notch1、Notch2和Jagged1相对于β-actin的基因表达量。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件包进行统计。各组数据采用均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析，组间比较用SNK方法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高浓度葡萄糖抑制RANKL诱导的破骨细胞分化 TRAP染色定量分析破骨细胞分化情况，每组重复三次。图1示多核且TRAP染色为阳性的破骨细胞。从图2中可以看出，葡萄糖浓度达到10 mmol/L时与对照组差异无统计学意义，随着葡萄糖浓度的继续增高，破骨细胞数目减少，实验组(20 mmol/L葡萄糖)破骨细胞个数为(110.3±6.81)，对照组(20 mmol/L甘露醇)破骨细胞个数为(152.7±7.0)；当葡萄糖浓度增高至40 mmol/L，实验组破骨细胞个数为(72.0±8.0)，而对照组(40 mmol/L甘露醇)破骨细胞个数为(157±12.5)，实验组与对照组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。该结果提示高糖环境可以抑制RANKL诱导的破骨细胞分化。

图1 破骨细胞显微镜下观

图2 高糖条件下RANKL诱导破骨细胞的数量

2.2 高浓度葡萄糖抑制Notch2基因mRNA表达 实时定量PCR定量分析Notch1，Notch2和Jagged1表达情况，每组重复3次。葡萄糖浓度达到10 mmol/L时，Notch1、Notch2和Jagged1表达水平与对照组差异无统计学意义，随着葡萄糖浓度的继续增高，Notch1和jagged1的表达水平无明显变化，但Notch2受体表达水平逐渐降低。实验组(20 mmol/L葡萄糖)Notch1、Notch2和Jagged1的相对表达量分别为(1.25±0.43)，(1.65±0.23)和(1.16±0.38)，对照组(20 mmol/L甘露醇)Notch1、Notch2和Jagged1的相对表达量分别为(1.84±0.38)，(2.82±0.28)，和(1.52±0.26)；当葡萄糖浓度增高至40 mmol/L，实验组Notch1、Notch2和Jagged1的相对表达量分别为(1.14±0.45)，(1.1±0.11)，(1.09±0.23)，对照组(40 mmol/L甘露醇)Notch1、Notch2和Jagged1的相对表达量分别为(1.66±0.40)，(2.42±0.27)，(1.45±0.34)。实验组与对照组间Notch2的表达水平差异有统计学意义(P<0.05)(见图3)。该结果提示高糖环境抑制RANKL诱导Notch2表达。

图3 实时定量PCR分析高糖对RANKL诱导Notch1、Notch2和Jagged1表达的影响

3 讨论

糖尿病和骨代谢疾病(如骨质疏松)是影响人类生活健康的两大常见疾患，二者发病机制密切相关，骨骼亦是糖尿病慢性并发症的受累器官之一[6-7]。众多研究已证实，高血糖状态引发骨质疏松主要是通过抑制成骨细胞的骨形成过程[8]。但是，有关高血糖状态下骨代谢过程中另外一个主要功能细胞-破骨细胞的研究较少。

正常成人在生理状态下，通过破骨细胞的骨质再吸收和成骨细胞精确协调，保持骨质的不断更新。破骨前体细胞向破骨细胞分化及其骨吸收过程中，受到破骨细胞活化因子(如RANKL)及破骨细胞抑制因子系统(如OPG)的精密调控[9]，同时，也需要葡萄糖作为基本的能量代谢物质。人体内正常血糖浓度大约为5.5 mmol/L，因此本实验选择葡萄糖浓度为5.0 mmol/L，10 mmol/L，20 mmol/L，40 mmol/L的α-MEM培养基培养破骨前体细胞。从本研究结果可以看出，各组均有破骨细胞形成，随着葡萄糖浓度的增高，多数实验组破骨细胞的数量少于对照组，二者间差异有统计学意义。该研究结果与Wittrant等[1]的报道一致。本研究提示RANKL能诱导破骨前体细胞向破骨细胞分化，而高糖环境可以抑制破骨细胞分化，并且呈现出浓度依赖性，总体趋势是浓度越大，抑制破骨细胞分化的能力越强。

基于Notch信号在生物进化中的保守性及其作用的广泛性[10]，本研究欲初步探讨高糖条件下破骨细胞分化过程中，Notch信号通路基因的相关变化情况。Notch基因最早发现于果蝇，该基因的部分功能缺失会在果蝇翅膀的边缘造成缺口(Notch)，Notch基因由此而得名。脊椎动物中有4个Notch同源体：Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。Notch配体共有5种，分为两个家族：Jagged 家族(Jagged1、Jagged2)和Delta-like家族(Delta1、Delta3和Delta4)。最新研究表明Notch2受体与配体Dll1结合后，正向调控破骨细胞分化过程；而Notch1受体与Jagged1配体结合负向调控破骨细胞分化过程[2]。本实验研究主要检测高糖条件下，RANKL诱导破骨前体细胞向破骨细胞分化过程中，细胞表面Notch1、Notch2、Jagged1的表达情况。研究结果表明RANKL促进破骨前体细胞Notch1、Notch2、Jagged1基因的mRNA表达水平，该研究结果与一些学者[3-5]报道一致。但随着葡萄糖浓度的增高，实验组Notch2的表达水平低于对照组，二者之间差异具有统计学意义。说明RANKL能提高细胞Notch2的表达水平，而高糖环境抑制Notch2的表达，提示Notch2信号可能参与调控高糖环境下RANKL诱导的破骨细胞分化过程。然而，在高糖条件下，有关Notch信号途径中受体与配体具体相互作用方式与及其机制尚不明确。因此，针对高糖条件下Notch信号在破骨细胞分化过程中的作用需进一步研究探讨。

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[4]Bai S,Kopan R,Zou W,et al.NOTCH1 regulates osteoclastogenesis directly in osteoclast precursors and indirectly via osteoblast lineage cells[J].J Biol Chem,2008,283(10):6509-6518.

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