p53基因多态性与鼻咽癌遗传易感性的关系

楼建军 朱小东 曲 颂 潘闻燕 李小宇 (广西医科大学附属肿瘤医院，广西 南宁 530021)

鼻咽癌(NPC)是我国常见的恶性肿瘤之一，在头颈部恶性肿瘤中占首位。据统计:世界上大多数地区NPC的发病率在1/10万以下，而我国南方某些地区高达33/10万(男)、15.60/10万(女)〔1，2〕。p53基因与 NPC 发生的关系引起了研究者的注意。本研究收集了临床资料完整的NPC病人的血液标本和对照人群的血液标本，研究p53基因的单核苷酸多态性(SNP)与NPC发生的关系，为NPC基础研究和临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2010年3月至2011年9月在我院放疗科住院的NPC患者(NPC组)200例。男女各100例，年龄25～70〔平均(47±19)〕岁。所有患者均经病理学证实，住院前均未接受过化学治疗、放射治疗或生物治疗等干预措施。主要临床表现:颈部包块84例;鼻部症状:血涕70例，鼻堵42例，鼻出血19例;耳部症状56例;头痛43例;颅神经症状48例。对照组200例，为同期身体健康的志愿献血者，男女各100例，年龄21～50〔平均(38±12)〕岁。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2.2 引物设计 由Primer 5.0引物设计软件设计，上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游5′－GAGGAGGGACGGTTGGTT－3′;下游 5′－GGTGAGTGAGGAGGTGCTG－3′。

1.2.3 PCR 扩增 25 μl反应体系含2 ×PCR TaqMix 12.5 μl，灭菌水 9.5 μl，DNA 模板 1.0 μl，上游引物 1.0 μl，下游引物1.0 μl。PCR反应采用型号 PXE0.2、Thermo公司的 PCR仪。95℃预变性，5 min;进入循环:变性95℃，30 s;退火61℃，30 s;延伸72℃，30 s;共30个循环。终末延伸72℃，8 min。取PCR产物8 μl在含溴乙啶的2%琼脂糖凝胶电泳，电泳后将凝胶置于凝胶成像系统(Alphalmager，美国)观察结果。

1.2.4 PCR产物纯化(试剂盒法) 试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。

1.2.5 酶切反应体系 体系为10 μl，其中 PCR纯化产物5.0 μl，10 × 限制性内切酶缓冲液 1.0 μl，AciI 内切酶 0.3 μl，灭菌双蒸水 3.7 μl，37℃温育 16 h。

1.2.6 测序分析 随机挑选部分PCR纯化产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序，以检验分型是否准确。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行分析，组间人群基因进行Hardy－Weinberg遗传平衡吻合度检验，计数资料以百分率表示，进行χ2检验。

2 结果

2.1 PCR扩增结果 扩增出的PCR产物片段长为180 bp，见图1。

2.2 酶切结果分析 p53基因rs117562731位点野生纯合子基因型为CC型，电泳图上见115 bp和65 bp的两条带;突变纯合子基因型TT型，电泳图上见180 bp一条带;杂合子基因型为CT型，电泳图上见180 bp、115 bp和65 bp的三条带。见图2。

2.3 Hardy－Weinberg遗传平衡检测 将两组的等位基因频率进行Hardy－Weinberg遗传平衡吻合度检测，各基因型频率与期望值吻合度较好，基因型分布符合Hardy－Weinberg遗传平衡(P＞0.05)。

2.4 p53基因与NPC的相关性分析 在NPC组携带CC、CT及TT基因型频率分别为80.0%、17.0%和3.0%，在对照组中分别为93.0%、5.5%和1.5%。CT+TT基因型发生NPC的风险是CC基因型的3.321倍(P=0.000，OR=3.321，95%CI:1.744～6.326)，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.5 NPC组临床特征与p53基因 rs117562731位点多态性比较 根据临床特征进一步分析，结果提示各基因型与T分期、N分期及M分期无显著相关性(P＞0.05)。见表2。

图1 rs117562731位点PCR扩增目的片段为180 bp

表2 NPC组不同临床分型与p53 rs117562731多态性的关联性分析〔n(%)〕

图2 rs117562731位点酶切图

表1 p53 rs117562731基因型与NPC风险的关系〔n(%)，n=200〕

3 讨论

p53基因编码一种分子量为53 000的磷酸化蛋白质，所以称为p53基因。正常p53基因的生物学功能好似“基因组卫士”，在G1期检测DNA的损伤点，监视细胞基因组的完整性。如果DNA有损伤，p53基因阻止DNA复制，使损伤的DNA得以修复;若修复成功，DNA继续复制;如果修复失败，p53基因则引发凋亡〔3〕，使损伤的DNA不能继续复制。p53基因突变可增加正常细胞对突变剂的敏感性，结果导致正常细胞癌变概率增加，使肿瘤的发病率增加。p53基因结构和功能改变与多种肿瘤的发生发展关系密切〔4〕。p53基因的点突变、变异和多态性与NPC的发病相关性研究较少，本研究结果表明CT+TT基因型与CC基因型相比，其患NPC的风险显著增加。揭示本位点与NPC的易感性有明显相关，说明此位点是NPC发生的危险因素。而且各基因型与T、N及M分期无显著相关性。

超过50%的人类肿瘤中有p53基因功能失活及突变，以结肠癌、肺癌、乳腺癌和胰腺癌的突变最为常见〔5，6〕。Shirai等〔7〕研究发现p53基因多态性与胃癌的发生有关联，也与胃癌的侵袭和进展有显著的相关性。Phang等〔8〕研究表明p53基因多态性与多种癌症的风险有显著的相关性。Saeki等〔9〕也证实p53基因多态性与食管鳞状细胞癌的发生有关联。Liu等〔10〕发现p53基因相关位点的SNP增加了患乳腺癌的风险。Sun等〔11〕研究发现p53基因与前列腺癌的发生与进展有显著的相关性。p53基因功能失活有多种方式:①p53基因的SNP突变:其中最为主要是点突变引起的错义突变，其比例约占80%左右。②被DNA肿瘤病毒蛋白失活。③被Mdm蛋白抑制。④p53基因的误位。本实验研究主要针对基因点突变方面进行研究，结果显示选取的p53 rs117562731 SNP位点携带的变异等位基因在NPC组与对照组之间有显著性差异，说明此位点的突变有可能是导致NPC发生和发展的一个重要因素，但其确切机制仍不清楚。

1 殷蔚伯，余子豪，徐国镇，等.肿瘤放射治疗学〔M〕.第4版.北京:中国协和医科大学出版社，2008:443－9.

2 朱广迎.放射肿瘤学〔M〕.第2版.北京:科学技术文献出版社，2007:231－2.

3 郑 杰.肿瘤的细胞和分子生物学〔M〕.第2版.上海:上海科学技术出版社，2011:104－8.

4 Knudson AG.Two genetic hits(more or less)to cancer〔J〕.Nat Rev Cancer，2001;1(2):157－62.

5 Selivanova G.Therapeutic targeting of p53 by small molecules〔J〕.Semin Cancer Biol，2010;20(1):46－56.

6 Shangary S，Wang S.Small－molecule inhibitors of the MDM2－p53 proteinprotein interaction to reactivate p53 function:a novel approach for cancer therapy〔J〕.Annu Rev Pharmacol Toxicol，2009;49(1):223－41.

7 Shirai O，Ohmiya N，Taguchi A，et al.P53，p21，and p73 gene polymorphisms in gastric carcinoma〔J〕.Hepatogastroenterology，2010;57(104):1595－601.

8 Phang BH，Chua HW，Li H，et al.Characterization of novel and uncharacterized p53 SNPs in the Chinese population－－intron 2 SNP co－segregates with the common codon 72 polymorphism〔J〕.PLoS One，2011;6(1):e15320.

9 Saeki H，Kitao H，Yoshinaga K，et al.Copy－neutral loss of heterozygosity at the p53 locus in carcinogenesis of esophageal squamous cell carcinomas associated with p53 mutations〔J〕.Clin Cancer Res，2011;17(7):1731－40.

10 Liu J，Desai KV，Li Y，et al.Germ－line variation at a functional p53 binding site increases susceptibility to breast cancer development〔J〕.Hugo J，2009;3(1－4):31－40.

11 Sun T，Lee GS，Oh WK，et al.Single－nucleotide polymorphisms in p53 pathway and aggressiveness of prostate cancer in a Caucasian population〔J〕.Clin Cancer Res，2010;16(21):5244－51.