牛病毒性腹泻病毒抗原即时检测试剂盒的性能评价

罗海峰 葛艳华 Gu Hao-yi Anton Mestek Jr. 翁立楠 Christian Schelp Christoph Egli Serge Leterme

1.北京爱德士元亨生物科技有限公司，北京 101300；2.IDEXX Laboratories Inc.，Westbrook-Maine 04092；3.IDEXX Switzerland AG，Liebefeld-Bern 3097

牛病毒性腹泻-黏膜病（bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的主要发生于牛的一种急性、热性传染病，在临床上引起一系列复杂的症状，主要包括牛的病毒性腹泻、急慢性黏膜病、免疫耐受和持续性感染、免疫抑制、繁殖障碍、血小板减少和出血症等，致病机理非常复杂[1-3]，严重影响养牛业生产的各个环节。同时，牛病毒性腹泻病毒是一种世界范围广泛分布的危害动物健康的重要病原体，它不仅感染牛，而且能够感染猪、绵羊、山羊、鹿、骆驼及其它野生动物[1,3]。

妊娠母牛感染非致细胞病理变化型BVDV后，此时胎儿的免疫系统尚未发育成熟，不能识别外来的BVDV，初生犊牛一旦成活，其临诊症状表现正常，血清学反应呈阴性，而此时犊牛则处于免疫耐受状态，成为持续感染（Persistently infected，PI）者，持久带毒、排毒，PI牛也就成为了BVDV在牛群中流行的传染源[1-5]。有些PI牛会表现出黏膜病的症状（腹泻、发育不良、久配不孕等），但是有些PI牛不表现任何症状，从而被当作正常牛只一直在牛群饲养[6]，并使BVDV在牛群中传播。可见对于BVDV持续感染牛的检测将有利于牛群生长发育。本文对于新近开发的牛病毒性腹泻病毒抗原即时检测（BVDV Ag POC）试剂盒的性能进行了评价，通过与酶联免疫吸附试验（ELISA）进行比较探索其用于检测BVDV持续感染牛的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

Erns（gp48）蛋白由IDEXX Switzerland AG瑞士研发中心提供；不同亚型BVDV抗原阳性血清样本由IDEXX Laboratories Inc.美国研发中心提供；BVDV Ag ELISA试剂盒及BVDV Ag POC试剂盒均来自于IDEXX Laboratories Inc.；全血样本、血浆样本以及小耳组织样本来自于牛场。

1.2 方法

1）BVDV Ag ELISA检测血清血浆的操作方法。血清血浆样本直接加入到ELISA板内，按照产品说明书进行孵育和后续操作。设2孔阴性对照和2孔阳性对照，阳性对照平均值减去阴性对照平均值，其差必须大于或等于0.150；通过计算每个样品与阴性对照平均值的差值（S-N）来判定BVDV抗原结果。如果S-N值小于或等于0.300，判为BVDV抗原阴性；如果S-N值大于0.300，判为BVDV抗原阳性。

2）BVDV Ag ELISA检测小耳组织样本的操作方法。对于小耳组织样本首先采用耳组织浸泡液在室温下浸泡12～24h后，混匀，取样加入ELISA板内，按照产品说明书进行孵育和后续操作。设2孔阴性对照和2孔阳性对照，阳性对照平均值减去阴性对照平均值，其差必须大于或等于0.150；通过计算每个样品与阴性对照平均值的差值（S-N）来判定BVDV抗原结果。如果S-N值小于或等于0.200，判为BVDV抗原阴性；如果S-N值小于或等于0.300但大于0.200，判为可疑；如果S-N值大于0.300，判为BVDV抗原阳性。

3）BVDV持续感染牛的判定。对于第1次采样检测BVDV抗原阳性的牛只，在7～14d后再次进行采样，并使用BVDV Ag ELISA进行检测。如果再次检测为BVDV抗原阳性，则该动物为BVDV持续感染牛；如果再次检测结果为BVDV抗原阴性，则该动物不是BVDV持续感染牛。

4）BVDV Ag POC检测全血、血清和血浆的操作方法。将检测装置放在平整的桌面上，使用提供的滴管滴将1滴样本滴入检测装置的加样孔中，1min内滴加2滴缓冲液并且开始计时，15min后观察结果；质控线位置呈现红色条带显示试验有效；检测线的颜色强于背景结果，判为阳性；检测线的颜色与背景颜色相同或弱于背景颜色，结果为阴性。

5）BVDV Ag POC检测耳组织样本的操作方法。耳组织样本装入样品管中，然后滴加8滴（对于小耳组织样本）或者16滴（对于大耳组织样本）缓冲液，浸泡5min以上，彻底混匀后使用提供的滴管滴将1滴样本滴入检测装置的加样孔中，1min内滴加2滴缓冲液并且开始计时，15min后观察结果。质控线位置呈现红色条带显示试验有效；检测线的颜色强于背景颜色，判为阳性；检测线的颜色与背景颜色相同或弱于背景，结果为阴性。

2 结果与分析

2.1 对于Erns蛋白的检测及稀释灵敏度比较

对于采用基因工程表达的Erns蛋白进行系列稀释，并且采用BVDV Ag ELISA和BVDV Ag POC分别进行检测，检测结果见表1。

由表1可见，BVDV Ag POC可以有效检测Erns，并且对于Erns的稀释灵敏度与ELISA相同。

2.2 对于BVDV 1型和2型血清的检测

使用BVDV Ag POC检测21份已知病毒亚型的BVDV Ag阳性血清，其中包含有13份BVDV 1型血清和8份BVDV 2型血清，检测结果见表2。

由表2可见，BVDV Ag POC可以有效检测BVDV 1型和2型病毒。

2.3 对于全血样本的检测

自9个牛场收集824份全血样本，采用BVDV Ag POC进行检测，记录结果。采用BVDV Ag ELISA对于全血样本分离得到的血浆进行检测，对于阳性结果的牛只1周以后再次采血进行检测，如果再次为阳性，则判定为持续感染（PI），并且记录相应结果。将BVDV Ag POC检测结果与BVDV Ag ELISA检测的PI结果相比对，结果见表3。

表1 Erns蛋白系列稀释的检测结果

表2 对21份已知BVDV亚型血清样本的检测

由表3可见，与BVDV Ag ELISA相比，BVDV Ag POC对于全血样本检测的灵敏度是100.0%，特异性为99.1%。

2.4 对于血浆样本的检测

自9个牛场收集587份血浆样本，采用BVDV Ag POC进行检测，记录结果；同时采用BVDV Ag ELISA进行检测，对于阳性结果的牛只1周以后再次采血进行检测，如果再次为阳性，则判定为持续感染，并且记录相应结果。将BVDV Ag POC检测结果与BVDV Ag ELISA检测的PI结果相比对，结果见表4。

由表4可见，与BVDV Ag ELISA相比，BVDV Ag POC对于血浆样本检测的灵敏度是100.0%，特异性为99.4%。

表3 BVDV Ag POC检测全血样本

表4 BVDV Ag POC检测血浆样本

表5 BVDV Ag POC检测小耳组织样本

2.5 对于耳组织样本的检测

自4个牛场收集400份小耳组织样本，采用BVDV Ag POC进行检测，记录结果；同时进行BVDV Ag ELISA检测，对于阳性结果的牛只1周以后再次采样检测，如果再次为阳性，则判定为持续感染，并且记录相应结果。将BVDV Ag POC检测结果与BVDV Ag ELISA检测的PI结果相比对，结果见表5。

由表5可见，与BVDV Ag ELISA相比，BVDV Ag POC对于全血样本检测的灵敏度是100%，特异性为100%。

3 讨论

目前OIE推荐的BVDV抗原检测方法，也是国际贸易标准方法，包括病毒分离（Virus Isolation）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫组化（Immunohistochemistry）以及核酸检测（Nucleic acid detection）[2]。目前ELISA方法作为检测牛病毒性腹泻病毒的经典方法，已经被应用于多个国家的净化计划中，其特异性强、灵敏度和可靠性都很高[4,7-8]。但是由于目前OIE推荐的4种方法均需要一定的实验条件，并且试验结果需要经过几小时到几天的时间才可获得。因此开发一种灵敏度、特异性与ELISA方法相似，同时操作简便、不需要特殊仪器的检测方法，对于小型农场的疾病防控，以及在需要尽快获得检测结果的场合下使用，具有重大的优势。牛病毒性腹泻病毒抗原即时检测试剂盒采用胶体金技术，运用侧向层析原理，可以在加入样本后15min获得结果，所有反应在室温下即可完成，不需要任何其他仪器及特殊的实验条件，完全达到快速检测的要求，可以满足各种环境下对于单一样本快速检测的需求。

PI牛的清除是牛场清除BVDV的重要目标，运用适当的检测手段检出这些PI牛，一定要在第一时间将它们隔离出群，并尽早淘汰。实验结果表明，BVDV Ag POC检测标的物为 Erns，Erns蛋白为检测BVDV的重要靶蛋白[5,9]，该试剂盒可以准确有效地检测出样本中BVDV的存在；对于1型和2型BVDV均可以检测。对于824份全血样本、587份血浆样本以及400份小耳组织样本的检测显示，所有的PI牛全被BVDV Ag POC检测出，灵敏度达到100%，针对不同类型的样品，BVDV Ag POC特异性略有不同，但都超过99%。该结果显示BVDV Ag POC与ELISA方法具有极高的符合性，其性能可以满足对于BVDV PI牛检测的需求。

据文献报道，对北京地区7个规模化奶牛场共14028头荷斯坦奶牛进行BVDV抗原检测.共检出PI牛58头，其中成母牛9头，后备牛49头；场内阳性率0.04～1.02%[6]。从河北省部分牛场采集1030份样本进行BVDV抗原检测，平均检出率40.9%[10]。可见，BVDV广泛存在于国内的牛场中。参照瑞典净化BVDV的经验，明确牛只感染状况，及时清除PI牛，同时控制引入的牛只，将有助于病毒的净化。而BVDV Ag POC作为可以单一检测的快速检测试剂盒，可用于及时明确新生犊牛、引入牛只的BVDV感染状况。同时欧洲的清除计划也显示出快速确定牛只感染状况，也有利于清除病毒[1,4,7-8]。由此，牛病毒性腹泻病毒抗原即时检测试剂盒作为一个可以快速检测样品中BVDV抗原的试剂，可以成为牛场进行BVDV的防控及清除的有力工具。

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