缺血-再灌注对甲床损伤机制的实验研究

欧春培 利春叶 李晓文 陈国艺 贾赛雄

南方医科大学附属深圳宝安医院上肢显微外科，广东 深圳 518101

缺血-再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）所致人体各个组织和器官的损伤在临床并不少见，包括术中为避免出血人为阻断组织和器官的供血后再灌注的损伤。如骨科常用止血带限时地压迫主要供血血管而达到四肢手术和创伤出血中的止血，临床中笔者观察到手外伤患肢正常使用止血带，缺血再灌注后未受伤手指指甲也会出现畸形生长，其机制尚不清楚。本研究在动物模拟实验的基础上探讨使用止血带后缺血再灌注对甲床的损伤及其相应的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂

超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒和TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，Trizol购自分子探针公司，RT-PCR和荧光定量检测Real Time试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 实验动物

健康雄性大耳白兔 50只，体重（6.0±1.2）kg，购自中山大学动物实验中心。动物随机分为5组：对照组、缺血30、60、90、120 min组，每组各 10只。

1.3 缺血再灌注动物模型的制备

3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（1 mg/kg），固定实验组大耳白兔，于右后肢根部上止血带，松紧度以腘动脉搏动消失为准，分别于缺血30、60、90、120 min再灌注1 h后剥离甲板，用于后续试验。

1.4 SOD活性的测定

手术取出的局部甲床组织匀浆，严格按照试剂盒的说明书操作，采用分光分析法检测标本中超氧化物歧化酶（SOD）活性[1]。

1.5 组织TNF-α基因表达的荧光定量PCR检测

手术取出的局部甲床组织匀浆，按照Trizol和反转录试剂盒说明书操作，提取细胞总RNA和反转出cDNA的第一链，按照Real-Time试剂盒说明书操作，使用ABI 7000荧光定量PCR仪检测TNF-α基因的表达。TNF-α基因：上游引物5'-ACACCCACGTCGTAGCAAACCAC-3'，下游引物 5'-ACACCCATTCCCTTCACAGAGC-3'；内参照GAPDH基因：上游引物 5'-GGATTTGGTCGTATTGGG-3'，下游引物 5'-GGAAGATGGTGATGGGATT-3'，反应条件为：95°C 15 s，60°C 1 min，35个循环。以内参照计算△Ct值，△Ct值越小说明基因拷贝数越多[2]。

1.6 甲床组织细胞凋亡的TUNEL检测

手术取出的局部甲床组织予4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，制备4 μm厚的切片，按试剂盒要求使用末端转移酶介导脱氧尿苷三磷酸（TUNEL）法标记凋亡细胞。每张切片在高倍镜下随机选择5个视野，计数阳性染色细胞，计算细胞凋亡率（%）=（阳性染色细胞/整个视野内的细胞）×100%。

1.7 统计学方法

运用SPSS 13.0对数据进行处理，计量资料以均数±标准差（）表示，采用t检验，计数资料采用百分率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缺血不同时间再灌注后甲床组织SOD活性的动态变化

与对照组比较，甲床组织缺血30 min后再灌注，SOD活力无显著改变（P>0.05），缺血 60、90、120 min 后再灌注其SOD活力显著降低（P<0.01）。见表1。

2.2 缺血不同时间再灌注后甲床组织TNF-αmRNA表达的变化

与对照组比较，甲床组织缺血30 min后再灌注，TNF-α mRNA的表达无显著改变 （P>0.05），缺血60 min后再灌TNF-α mRNA的表达显著增加（P<0.01）。见表1。

2.3 缺血不同时间再灌注后甲床组织细胞凋亡的变化

与对照组比较，甲床组织缺血30 min后再灌注，细胞的凋亡率无显著改变（P>0.05），缺血60 min后再灌注细胞的凋亡率随着缺血时间的延长而相应的增加（P<0.01），但缺血90 min后细胞的凋亡率不再增加，与缺血120 min后再灌注比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 缺血不同时间再灌注后甲床组织超氧化物歧化酶活性、肿瘤坏死因子-α mRNA表达、细胞凋亡的变化（）

表1 缺血不同时间再灌注后甲床组织超氧化物歧化酶活性、肿瘤坏死因子-α mRNA表达、细胞凋亡的变化（）

注：与对照组比较，*P<0.01；与缺血再灌注60 min比较，▲P<0.01

检测指标 对照组 缺血时间30 min 60 min 90 min 120 min SOD活性（U/mg）TNF-α mRNA细胞凋亡率（%）11.05±2.1712.67±1.515.44±1.31*5.22±1.34*5.52±1.04*22.41±3.622.31±1.2222.74±1.243.44±2.0116.21±3.10*12.27±2.54*14.67±2.33*21.66±2.14*▲13.04±3.12*20.78±1.87*▲

3 讨论

人类甲床和指甲不仅具有美观的功能，而且具有手指的抓、捏、持、拿等稳定功能，所以手指外伤后指甲的外观及功能恢复十分重要。临床工作中发现：一方面很多甲床损伤患者术后并发指甲畸形；另一方面上臂正常使用止血带后，未受伤手指也出现指甲生长畸形，其机制笔者考虑可能是缺血-再灌注损伤所致[3]。

缺血-再灌注损伤是指组织器官在缺血一定程度和时间后再重新恢复血供，不仅不能使组织恢复正常的代谢功能，反而会加重损伤，甚至使病情更加严重的一种病理生理现象[4]。缺血-再灌注损伤中氧自由基的产生是最主要的损伤因素，其不仅直接损伤再灌注的细胞，而且还会激发一系列的炎性反应。SOD可以高效的清除氧自由基[5]，而笔者的研究显示缺血再灌注后甲床组织中的SOD显著减少。TNF-α也是体内一个重要的炎症因子，由巨噬细胞产生，其表达的升高可诱导细胞的凋亡，同时还可以诱导氧自由基的产生，进一步加重损伤[6]。笔者的研究也显示了甲床组织缺血再灌注后TNF-α mRNA的表达显著升高（P<0.01），并且甲床组织细胞的凋亡率也相应的升高。有研究提示，在手外伤手术松止血带后可以使用一些氧自由基清除剂来预防甲床组织凋亡的发生，或者缺血预处理较少相关炎症因子的产生来达到预防术后指甲畸形的发生。笔者的研究显示甲床组织缺血30 min后再灌注SOD活力、TNF-α mRNA表达和细胞凋亡率无显著改变（P>0.05），说明短暂的缺血再灌注不会导致甲床的损伤，所以严格控制止血带的时间是预防术后指甲畸形的一个有效方法。

综上所述，本研究显示缺血60 min后再灌注可以诱发甲床细胞凋亡的发生，SOD的减少和TNF-α表达的升高是导致细胞凋亡的主要原因。甲床损伤患者术后并发指甲畸形一方面是由于甲床自身损伤，另一方面可能是缺血-再灌注损伤所致。而上臂正常使用止血带后，未受伤手指也出现指甲生长畸形，其原因可能是由缺血-再灌注直接损伤所致。

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