新型钾通道开放剂(QO-58)在大鼠体内组织分布研究

刘灿仿，祁金龙，张海林，贾庆忠

(1.河北医科大学药理教研室，教育部血管与神经生物重点实验室，河北省新药药理毒理重点实验室，河北石家庄 050017;2.邢台医学高等专科学校药剂教研室，河北邢台 054000)

QO-58为吡唑并［1，5-a］嘧啶酮类化合物，其结构比较新颖，生物活性较高，是经过高通量筛选发现的一个新型的钾通道开放剂，对电压依赖性M-通道(KNQ2/3通道)有良好开放活性，M-通道主要分布于神经系统，并且在神经细胞兴奋的阈电位附近开放，对调节神经兴奋性起重要作用。细胞学试验结果显示 QO-58开放 KNQ2/3通道的 EC50为0.21 μmol·L－1，与国外上市的 Retigabine(EC501.89 μmol·L－1)比较生物活性更强。前期药效学试验证实该物质对戊四唑诱发的小鼠癫痫和电刺激引发的惊厥有较好的作用，对缓激肽诱导的炎性疼痛也有效［1］。

药物在体内的分布与药理作用密切相关，药物只有进入靶器官并达到一定浓度才能发挥药效，而进入其他器官则无药理作用或产生不良反应。影响药物分布的因素很多，主要包括:体内循环与血管通透性，药物与血浆蛋白结合能力，药物的理化性质与透过生物膜的能力，药物与组织的亲和力等。因此，了解药物在组织中的分布情况，对新药的研发有着重要意义。

QO-58化合物我们已经申请了专利保护，目前缺少关于该物质药代动力学和组织分布的研究资料，为了进一步弄清楚该物质在体内的吸收、分布规律，我们通过RP-HPLC方法观察了在大鼠体内的组织分布特征，以阐明QO-58在大鼠体内的变化规律，为进一步的新药研究与开发提供科学依据［4］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器和器材 岛津LC-20AT高效液相色谱仪，岛津LC-solution色谱工作站;HGC-24A型氮气吹干仪(天津市恒奥科技发展有限公司);Eppendorf centrifuge 5417R型高速离心机;Ke-400kDB型高功率数控超声仪(昆山市超声仪器有限公司);Eppendorf centrifuge5810R大型离心机;D-78532 Tuttlingen型旋涡混合器;Heidolph DIAX 100型电动匀浆机等。

1.1.2 主要试剂 QO-58结晶高纯品:由河北医科大学新药研发中心提供(批号:2010003)，纯度为98.5%;乙腈和甲醇:色谱纯，德国 Merck(Honeywell)公司提供;N，N-二甲基乙酰胺为色谱纯，购自天津市光复精细化工研究所;聚氧乙烯蓖麻油为注射级(Cremophor ELP)，由河北医科大学药厂提供;尼群地平标准品:中国药品生物制品鉴定所提供(批号:100585-200602);乙酸铵:天津市化学试剂一厂提供。

1.1.3 实验动物 健康成年的清洁级SD大鼠共24只，♀♂各半，体质量220～250 g，购于河北省实验动物中心，合格证号:110305。实验前禁食12 h，自由饮水。

1.2 方法

1.2.1 灌胃用 QO-58溶液 取 QO-58原料药适量，用适量溶剂(N，N-二甲基乙酰胺:聚氧乙烯蓖麻油=1∶9)溶解，得到备用溶液。

1.2.2 色谱条件 色谱柱:Shim-pack VP-ODS C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，Shim-Pack VP-ODS 保护柱;流动相:乙腈 －0.2 mol·L－1乙酸铵(45 ∶55)，流速为1 ml·min－1，检测波长 285 nm;柱温:35℃;进样量:20 μl。

1.2.3 给药与组织样品采集 根据本实验室所做的QO-58药代动力学和药效学实验结果和《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》规定，确定大鼠组织分布实验在吸收相、分布相和消除相的取样时间分别为2、7、18、36 h，将24只大鼠随机分成4组，每组6只，确定组织分布采用的剂量均为50 mg·kg－1。于上述各时间点断头放血后处死6只大鼠，迅速取出心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、脑、肌肉、脂肪、睾丸、子宫，取到的样本必须有一致性和代表性，用生理盐水冲去其表面血污，再用滤纸吸干表面的浮血，称重，置于－80℃冰箱保存待用［2］。

1.2.4 组织样品处理和分析 各组织均称取实际重量，按1∶2的比例加乙腈适量，将组织匀浆，匀浆4 000 r·min－1离心 10 min，取上清 200 μl，加入乙腈 600 μl，涡旋混匀，12 000 r·min－1离心 10 min，取上清液700 μl室温氮气吹干，残渣加100 μl乙腈溶解，超声处理 5 min，12 000 r·min－1离心 10 min，取上清20 μl进样分析。结果代入相应的标准曲线求得各组织样品浓度。

2 结果

2.1 方法的专属性 取大鼠空白组织，不加内标溶液，按照“1.2.4”方法处理并分析，获得空白样品的色谱图;将规定浓度的QO-58标准溶液和内标溶液加入大鼠空白组织，同法操作，获得相应的色谱图;同法得到大鼠给药后组织样品色谱。通过对方法的专属性考察，结果显示各组织中的杂质对测定结果无干扰，QO-58与内标物的保留时间分别为11 min、13 min，两者峰形良好，分离度符合要求，肝脏典型色谱图见Fig 1。

2.2 标准曲线制作 精密量取 QO-58(500 mg·L－1)贮备液不同体积和内标溶液(220 mg·L－1)30 μl至EP塑料小管中，氮气吹干，加入空白组织200 μl混匀配制成 QO-58浓度为0.05～80 mg·L－1的系列浓度组织样品，每条标准曲线8个浓度，每个浓度平行处理样品5份，按照前述的样品处理及测定方法进行检测。以空白组织中药物的浓度(C)为横坐标X，药物和内标的峰面积比值(A)为纵坐标Y，以加权最小二乘法回归绘制标准曲线［5］。

Fig 1 Chromatograms of QO-58 in rat liver

在0.05 ～80 mg·L－1范围内，QO-58 在大鼠各组织中的浓度与QO-58和内标的色谱峰面积比线性关系良好，r值均大于0.9948。

2.3 最低定量限(LOQ)QO-58的检测限、定量限是在信噪比为S/N=3、S/N=10的基础上确定的，该方法的定量限为0.025 mg·L－1，检测限为0.01 mg·L－1。

2.4 精密度和准确度 按照前面组织处理方法制备成低、中、高(0.05、0.4、3.2 mg·L－1或 0.5、5、80 mg·L－1)3种浓度的QO-58的QC组织，平行操作5份，于同1天内测定3次，计算日内精密度。连续测定3 d，每天制备并根据随行标准曲线测定，计算日间精密度。各组织日内精密度RSD为2.15%～10.03%，日间精密度RSD为3.64% ～14.13%，符合要求［3］。

2.5 提取回收率实验 按照前面组织样品处理方法制备QO-58在组织样品中的高、中、低3个浓度的质量控制样品，以提取处理后的样品色谱峰面积与相应浓度的未经提取的样品直接进样获得的色谱峰面积之比，考察组织样品的提取回收率，实验结果显示回收率为94.27% ～108.08%，其相对偏差均小于10% ，说明该提取方法符合要求。

2.6 稳定性 按照前面组织样品处理方法制备成低、中、高3种浓度的QO-58的QC组织样品各3份，测定浓度的平均值，分别考察在室温放置2 h和4℃放置1周，－20℃放置18 d及3次冻融循环处理后在室温条件下的稳定性。

结果表明:经处理的模拟组织样品在室温放置2 h，－20℃冰箱中保存18 d，冻融经过3次循环;偏差都小于10%，样品在上述条件下均基本稳定［6］。

2.7 QO-58在大鼠体内组织分布 2 h时肝脏QO-58浓度最高，其次为血浆、胃、肠、肾、肺，浓度比较低的是心、脂肪、睾丸、脑等组织。7 h时胃中QO-58浓度最高，其次为肝脏、血浆、肺、肾、肠，浓度比较低的是肌肉、脂肪、脑等组织。18 h时肝脏中QO-58浓度最高，其次为血浆、肾、肺、胃、肠，浓度比较低是是肌肉、脂肪、脑等组织。36 h时各组织基本已经检测不到QO-58，结果见Fig 2。

Fig 2 Concentration of QO-58 tissues and plasma after oral administration of 50 mg·kg-1QO-58 to rats(n=6)

3 讨论

观察大鼠QO-58灌胃后组织分布结果，从各组织中药物浓度变化的时程看，含量呈动态分布，随着时间延长，各组织中药物含量也发生相应的变化。小肠的浓度在第1个观察点(2 h)最高，除给药方式的原因外，亦说明QO-58对小肠有特殊的亲和力。QO-58在各组织分布的时程变化与在血浆中药物浓度变化过程基本一致，提示没有明显的再分布现象［7］。

给药后2～7 h时胃中均保持一较高药物浓度，这可能是由于胃是给药部位，药物可经胃吸收。而7 h胃中药物浓度高于2 h胃中药物浓度是由于灌胃所用QO-58溶液采用了聚氧乙烯蓖麻油溶解，蓖麻油可以延迟QO-58在胃中的吸收。而无论2 h还是18 h肝脏中药物浓度始终比较高，提示药物可能主要在肝脏代谢。值得注意的是药物虽然脂溶性很高，但是并没有在脂肪、脑部位分布有明显增高，提示药物不会出现蓄积。药物在心脏分布浓度始终不高，这是一种很好的现象，由于药物对心脏的KCNQ1/KCNE1通道有开放活性，可能会因为在该组织分布浓度较低而不产生明显心脏毒性作用。给药7 h肾脏有较高药物浓度分布，提示药物可能会经过肾脏排泄。整个分布过程中，血浆中药物浓度始终比较高，仅次于肝脏，提示药物与血浆蛋白结合可能性比较大。至于药物为什么会在肺中有较高分布，及会带来哪些影响，还需要做进一步的研究。

尽管药物治疗癫痫的主要作用靶点在中枢(脑)，但在脑分布的浓度不是很高，提示药物可能不需要太高的剂量，只要保持脑内一定的药物浓度就会起效，因此低剂量重复给药可能要比高剂量单次给药方案更利于药效发挥。

由于QO-58为原料药，采用聚氧乙烯蓖麻油溶解后灌胃给药，导致大鼠组织样本中的浓度个体差异大，因此为了保证后期实验和临床给药的均一稳定，其制剂类型还需要进一步研究。

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