柔筋方对紧张型头痛大鼠张颌反射的影响及机制研究

吴宏赟 胡志强山东中医药大学附属医院神经内科，山东 济南 250011

据2010年国内流行病学调查发布数据显示，目前在我国18～65岁人口中，紧张型头痛 （tension-type headache，TTH）发病率为10.77%，约占原发性头痛的45.00%，是最常见的原发性头痛。随着生活习惯的改变，工作学习压力的增加，其发病率逐年增加。紧张型头痛发病机制尚不清楚，目前认为是颅周肌筋膜组织伤害性痛觉传入增强[1]，而内源性一氧化氮（NO）的生成则与血管周围传入神经纤维激活有关[2]。根据这一机制，参照Makowska等[3]的动物模型，笔者通过颈部双侧半棘肌局部注射ATP模拟伤害性刺激增强，采用神经电生理记录张颌反射（Jaw-opening Reflex，JOR）改变，定量分析柔筋方对紧张型头痛的疗效及可能的疗效机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级 Wistar大鼠 40 只，雌雄各半，体质量（254±28）g，购于山东大学实验动物中心[许可证号SCXK（鲁）20080002]。动物分笼饲养，自由饮水。实验动物配合饲料（鼠）：山东省实验动物中心提供[许可证号：SCXK（鲁）20090014]。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器与试剂 电子天平，大鼠固定器，大鼠手术台，BNI-A精密电子天平（台湾樱花），秒表，玻璃匀浆器，721分光光度计 （上海第三分析分析仪），YLS-9A电子刺激仪（Moorlab Serer），WZ-50C66T单通道微量注射泵 （浙江史密斯医学仪器有限公司），BioPAC多导生理信号采集分析系统，EMG100C放大器（美国BioPAC公司）。ATP（广东天丰药业有限公司，批号：090303）临用前用生理盐水配制成1μmol/L溶液；10%水合氯醛 （购于山东省齐鲁儿童医院）；一氧化氮合成酶 （NOS）抑制剂左旋硝基精氨酸 （L-NNA）（sigma产品，进口分装，购于上海信然生物技术有限公司）。

1.2.2 分组 假手术组10只（颈部注射生理盐水），模型组10只（颈部注射ATP），柔筋方组10只（颈部注射ATP+柔筋方煎剂灌胃），NOS抑制剂组10只 （颈部注射ATP+腹腔注射LNNA）。所有大鼠正常饲养15 d后开始实验。

1.2.3 方药制备 柔筋方煎剂按成人每日服用剂量：白芍40 g、炙甘草 10 g、木瓜 15 g、天麻 12 g、卷柏 10 g、羌活 10 g，以蒸馏水煎煮30 min，提取2次，再合并煎液，浓缩成含生药浓度为1 g/mL的混悬液[4]，避光贮于4℃冰箱中备用。

1.2.4 实验步骤 ①柔筋方组大鼠按每天1 mL/100 g体重灌胃用药，1次/d，连续用药1周。假手术组、模型组、NOS抑制剂组均给予等容积的动物饮用水。于末次给药后1 h进行实验。②麻醉采用10%水合氯醛3.5 mL/100 g腹腔注射，以应用钝钳对前后爪进行捏夹刺激不会引起任何反射活动为宜。③分离出大鼠双侧半棘肌及二腹肌，将大鼠右侧卧位，将两根不锈钢针刺激电极（直径150μm）纵向插入舌右侧，将两根记录电极插入右侧二腹肌前腹（两电极间距3～5 mm）肌肉内，以记录舌刺激诱发的二腹肌肌电反应(dEMG)，即JOR；同时将两台单道微量注射泵头皮针插入双侧半棘肌。NOS抑制剂组首先腹腔注射L-NNA溶液10 mg/kg，休息30 min后造模。④给予肌电刺激（刺激参数：方波刺激，频率为1次/s，波宽200 μs，强度0～10 mA），记录双侧半棘肌泵入 ATP前的JOR。5 min后假手术组予以双侧半棘肌同时以20 μL/min的速度泵入生理盐水，其余各组以同样速度泵入ATP，均持续1 min，然后给予舌肌电刺激，记录并测定JOR出现的阈值、潜伏期，连续测定3次，间隔2 min，取其平均值。给予舌电刺激后，可记录出一组复合波。以复合波中第一个峰出现的潜伏期来反映疼痛出现的潜伏期，以复合波中第一个峰出现的阈值作为JOR的阈值来代表痛阈。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件分析，计量资料数据以均数±标准差（）表示，采用配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

实验结果表明注射后模型组痛阈减低（P＜0.01）；而柔筋方组和NOS抑制剂组痛阈变化差异无统计学差异（P＞0.05），但显示升高的趋势，同时，这两组潜伏期延长（P＜0.05或P＜ 0.01）。 见表 1～2。

表1 不同组别刺激诱发大鼠张颌反射的疼痛潜伏期的变化（，ms）

表1 不同组别刺激诱发大鼠张颌反射的疼痛潜伏期的变化（，ms）

注：与注射前比较，*P＜0.01，**P＜0.05

组别 例数 疼痛潜伏期注射前 注射后假手术组模型组柔筋方组NOS抑制剂组10 10 10 10 4.42±0.58 4.64±0.44 3.97±0.53 4.09±0.33 4.41±0.59 4.58±0.52 4.20±0.47*4.18±0.29**

表2 不同组别刺激诱发大鼠张颌反射的疼痛阈值的变化（，mA）

表2 不同组别刺激诱发大鼠张颌反射的疼痛阈值的变化（，mA）

注：与注射前比较，*P＜0.01

组别 例数 疼痛阈值注射前 注射后假手术组模型组柔筋方组NOS抑制剂组10 10 10 10 6.50±2.56 5.34±1.88 5.73±1.85 7.25±1.85 6.60±2.31 4.54±2.12*5.42±2.09 6.89±1.85

3 讨论

JOR是一种在伤害和抗伤害研究中比较实用的模型，JOR的抑制作为镇痛指标是可行的[5]，该反射不能被芬太尼、纳洛酮和木防己苦毒素阻断[6]。本实验是通过给舌肌一定强度的电刺激来诱发JOR，将其出现的阈值代表痛阈，痛阈的提高说明动物对伤害性电刺激变得不敏感，起到了一定的镇痛作用[5]。实验结果表明造模后痛阈减低（P＜0.01）；而柔筋方组或NOS抑制剂组痛阈变化无统计学差异（P＞0.05），但显示升高的趋势，同时，这两组潜伏期延长（P＜0.05或P＜0.01），说明二者均可降低头颈部肌肉敏感性。实验结果表明，紧张型头痛可由NOS抑制剂部分阻断，结合既往研究紧张型头痛大鼠脑组织及血浆中NO、NOS含量均异常升高，说明紧张性头痛与NO相关，调节NO浓度是柔筋方干预紧张性头痛的靶点之一。

柔筋方干预紧张性头痛的具体机制仍不清楚，可能与NO浓度导致紧张型头痛模型大鼠痛敏机制有关。大量的实验证据表明NO在外周及中枢的不同水平的痛觉调制中起着重要作用。NO在外因伤害性信息传递中起促进作用。紧张性头痛患者血小板NOS活性的增加，反映了脊髓或三叉神经及脊髓上参与对肌筋膜伤害性刺激调节从而导致中枢致敏的NOS活性上调[7]。因此，给予NOS抑制剂后减弱了肌筋膜伤害性刺激致敏的影响。而Inoue等[8]发现NOS抑制剂必须通过环磷酸鸟苷（cGMP）途径减弱由N-甲基-右旋-天门冬氨酸(NMDA)诱发的热性痛觉过敏，抑制NO的生成是这个机制的一部分。提示柔筋方对大鼠痛觉的调制作用至少部分是通过NO-cGMP途径实现的[9]。

经临床观察，柔筋方加减治疗紧张型头痛具有疗效好、花费低的优势[10]，本研究显示该方药疗效机制之一是提高痛阈，降低头颈部肌筋膜敏感性，疗效与NOS近似。但柔筋方与NO浓度降低的因果尚不明确，可能是柔筋方通过降低NO浓度缓解紧张性头痛，抑或紧张性头痛缓解后减低NO浓度，孰因孰果需要进一步研究。

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[2]Ashina M，Simonsen H，Bendtsen L，et al.Glyceryl trinitrate may trigger endogenous nitric oxide production in patients with chronic tension-type headache[J].Cephalalgia，2004，24（11）：967-972.

[3]Makowska A，Panfil C，Ellrich J.ATP induces sustained facilitation of craniofacial nociception through P2X receptors on neck muscle nociceptors in mice[J].Cephalalgia，2006，26（6）：697-706.

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[7]于生元，刘若卓.紧张型头痛的研究进展[J].武警医学，2008，19（6）：541-542.

[8]Inone T，MashimoT，Shibata M，et al.Rapid development of nitric oxideinduced hyperalgesia depends on an alternate to the cGMP-mediated path way in the rat neuropathic pain mode [J].Brain Res，1998，792（2）：263-270.

[9]白波，刘文彦，宋朝佑.中枢神经系统一氧化氮对大鼠的痛觉调制作用[J].中国神经科学杂志，2003，16（1）：52-55.

[10]吴宏赟，胡志强，吕娟.慢性紧张型头痛风痰候中医综合治疗方案的卫生经济学评价[J].中国医药导报，2010，7（34）：19-21.