靶向舌癌Tca8113细胞血管内皮细胞生长因子基因的siRNA表达载体构建及体外抑制作用

姚志文 刘 唯 程由勇 李红玖 李春华 于大海

1.广州医学院附属深圳沙井医院口腔科，广东 深圳 518104；2.广西医科大学口腔医学院，广西 南宁 530021021

血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）能促进舌癌（carcinoma of tongue）中血管的生成，与舌癌的生长与转移密切相关[1-2]，抑制VEGF基因的表达可望抑制舌癌血管的生成，从而抑制舌癌细胞的增殖和转移。本研究以VEGF基因为靶点，构建VEGF-siRNA表达载体，转染舌癌Tca8113细胞，研究其对Tca8113细胞VEGF基因表达的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

Tca8113细胞株（四川大学口腔疾病研究国家重点实验室），Psilencer 2.1-U6-neo真核表达载体（美国 Ambion公司），脂质体 Lipofectamine 2000（美国 Invitrogen 公司），质粒小剂量提取试剂盒（美国Omega公司），大肠杆菌DH5α（武汉晶赛生物公司），G418试剂（美国Gbico公司），人VEGFELISA试剂盒 （上海森雄科技实业有限公司），限制性内切酶、T4 DNA连接酶 （美国NEB公司），HRP标记兔抗人的IgG抗体（美国Gbico公司），鼠抗人VEGF的单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 血管内皮细胞生长因子基因特异的siRNA表达载体构建 根据基因数据库已知VEGF mRNA序列，参考siRNA的设计有关文献[3]，设计针对VEGF基因不同剪切子的公共靶点，根据所选靶点人工合成VEGF基因RNAi靶序列（5′-GATAGAGCAAGACAAGAAA-3′）及其互补的反义链。以及一条实验对照序列（即无关序列HK：5′-GACTTCATAAGGCGCATGC-3'）及其互补的反义链。靶序列和实验对照序列各自的互补两条寡核苷酸片段经退火连接形成双链DNA模板链。用Bam HI+HindⅢ对质粒Psilencer 2.1-U6-neo进行双酶切。T4 DNA连接酶将线性化Psilencer 2.1-U6-neo和模板链连接成重组载体，靶序列与实验对照序列重组载体分别命名为Pu-VEGF-siRNA载体和Pu-HK载体。

1.2.2 重组载体的酶切和测序 重组的Pu-VEGF-siRNA和Pu-HK载体转化感受态 DH5α 细菌，50μg/mL的 Ampr抗性LB培养皿筛选阳性克隆，质粒提取试剂盒按说明提取重组载体。SalⅠ酶切重组载体，测序鉴定。

1.2.3 重组载体的转染 10%小牛血清的RPMI-1640培养基培养Tca8113细胞，于37℃、5%CO2孵箱中培养至对数生长期。以每孔1×106/mL细胞接种24孔培养板并培养过夜。按说明书使用Lipofectamine 2000将含有重组Pu-VEGF-siRNA和Pu-HK载体分别转染Tca8113细胞。实验分为三组，转染Pu-VEGF-siRNA为实验组，转染Pu–HK载体组作实验对照组，未转染组作空白对照组。实验组和实验对照组G418筛选1周后得到稳定转染细胞克隆。

1.2.4 免疫组织化学染色分析Tca8113细胞血管内皮细胞生长因子蛋白表达 常规SABC法检测Tca8113细胞VEGF的蛋白表达，各组随机选取100个Tca8113染色细胞，使用MIAS－2000医用彩色病理图像免疫组化测量系统对其灰度值进行测定。

1.2.5 酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbentassay，ELISA）测定Tca8113细胞上清液的血管内皮细胞生长因子蛋白表达 按照ELISA试剂盒操作说明进行操作，收集各组Tca8113细胞培养上清液，使用OD值作纵坐标，标准品浓度作横坐标，进行标准曲线绘制。根据Tca8113细胞上清OD值在标准曲线中可以查出对应浓度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行处理。计量资料数据以均数±标准差（）表示，多组间的比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组载体酶切鉴定

质粒Psilence 2.1-U6-neo基因序列里没有SalⅠ酶切位点，本研究插入的序列里设计有SalⅠ酶切位点，Pu-VEGF-siRNA和Pu-HK质粒均能被SalⅠ酶切，即均为插入正确的质粒（图 1）。

2.2 重组载体基因测序

经酶切鉴定的重组质粒送往上海生工公司进行DNA全长测序。所得结果如图2～3。经Blaster对比，测序结果与GenBank的VEGF基因序列完全一致，证实重组载体构建成功。

2.3 免疫组织化学染色SABC法分析Tca8113细胞血管内皮细胞生长因子蛋白表达

图1 重组载体的酶切鉴定

图2 Pu-VEGF-siRNA DNA测序

图3 Pu-HK DNA测序

图4 空白对照组Tca8113细胞胞浆染色明显（×400）

结果如图4～6所示，实验组细胞与实验对照组及空白对照组比较，细胞着色颗粒明显减少，而且着色变浅。对照组灰度值比实验组的明显降低（P＜0.05）。实验对照组与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 酶联免疫吸附法测定Tca8113细胞上清液血管内皮细胞生长因子蛋白表达

实验组细胞与实验对照组及空白对照组比较，VEGF蛋白浓度有所降低（P＜0.05）。以实验对照组VEGF相对水平作参照，实验组浓度下降34.64%。与空白对照组比较，蛋白质量浓度相似，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图7。

3 讨论

图5 实验对照组Tca8113细胞胞浆染色明显（×400）

图6 实验组TCA8113细胞胞浆染色减少（×400）

RNAi（RNA interference）是指由小分子双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，相应mRNA发生降解而导致基因表达沉默，它具有高稳定性、靶向性和高效率性等特点[4]，目前已经成为筛选新基因、基因功能研究、基因疾病治疗和寻找药物靶点的重要工具[5-7]。

本实验以人VEGF基因作为RNAi的靶基因，目的通过VEGF siRNA靶向阻断或抑制VEGF的表达，达到阻断或抑制VEGF促舌癌血管形成，进而抑制舌癌细胞增殖和转移的目的。VEGF mRNA的剪切方式的不同可产生5种不同形式蛋白分子：VEGF206、VEGF189、VEGF165、VEGF145、VEGF121。不同的VEGF分子协同作用促进肿瘤血管形成[8]。本实验利用基因重组技术，根据基因数据库已知VEGF mRNA序列，参考siRNA的设计有关文献，设计针对VEGF mRNA公共序列的靶点，体外构建Pu-VEGF-siRNA重组载体，然后利用转染技术将其转染Tca8113细胞并使其在细胞中稳定表达。常规SABC法和ELISA检测Tca8113细胞VEGF的蛋白表达结果表明：转染Pu-VEGF-siRNA重组载体后，实验组Tca8113细胞的VEGF蛋白表达较空白对照组和实验对照组有所减弱，而且空白对照组和实验对照组的VEGF蛋白表达无明显差异；说明所构建的真核表达载体Pu-VEGF-siRNA对人舌癌细胞株Tca8113中VEGF有较强的特异性抑制效果。这与其他学者[8]构建针对VEGFmRNA公共序列靶点，体外构建重组载体，转染相应癌细胞后有效抑制VEGF表达结果一致。

图7 三组细胞上清液血管内皮细胞生长因子蛋白浓度

笔者通过构建Pu-VEGF-siRNA重组载体并体外转染舌癌Tca8113细胞，实验结果表明能够特异和有效地抑制癌细胞VEGF的表达。这为应用RNA干扰技术对舌癌进行基因治疗提供了实验基础和理论依据，为舌癌的治疗选择开辟了新的途径。

[1]Castro-Rivera E，Ran S，Thorpe P，et al.Semaphorin 3B（SEMA3B） induces apoptosis in lung and breast cancer，whereas VEGF165 antagonizes this effect[J].Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（31）：11432-11437.

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[8]Zhang L，Yang N，Mohamed-Hadley A，et al.Vector-based RNAi，a novel tool for isoform-specific knock-down of VEGF and anti-angiogenesis gene therapy of cancer[J].Biochem Biophys Res Commun，2003，303（4）：1169-1178.