葡萄糖浓度波动对INS-1细胞胰岛素分泌的影响

林 占 薛耀明 关美萍

1.广东省惠州市中心人民医院内分泌科，广东 惠州 516001；2.南方医科大学南方医院内分泌代谢科，广东 广州 510515

高糖分为持续性高糖及波动性高糖，研究发现波动性高糖同样可以导致严重的胰岛素分泌功能的损伤[1-2]，其机制并未完全研究清楚。细胞ATP是近年来研究的热点，近年来发现胰岛素的分泌和胰岛β细胞内的ATP含量关系密切[3-4]。本实验拟用含不同葡萄糖浓度及是否含抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）的培养液干预INS-1细胞，通过比较持续性高糖及波动性高糖对ATP生成的影响及影响机制。

1 材料与方法

1.1 材料

RPMI 1640-培养基购自GIBAO，胎牛血清购自上海微科生化试剂有限公司，N-乙酰半胱氨酸及ATP检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 INS-1细胞贴壁生长于含有10%胎牛血清、0.6 mol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1 mmol/L丙酮酸钠、50 mol/L 2-巯基乙醇的普通RPMI 1640-培养基中，置于37℃、5%CO2、95%空气饱和湿度孵箱中培养。

1.2.2 实验分组 将INS-1细胞随机分为正常糖组（5.5 mmol/L葡萄糖培养液培养）、持续高糖组（16.7 mmol/L葡萄糖培养液培养）、波动组（用16.7 mmol/L葡萄糖培养液培养2 h，再换5.5 mmol/L培养3 h，每天重复3次，夜间9 h维持在5.5 mmol/L的培养液中）、NAC+正常糖组、NAC+持续高糖组、NAC+波动组，后3组的培养基中均预先负载终浓度为1.0 mmol/L NAC，余干预措施相同，均干预72 h。每组5个培养皿。各组每日均同时更换培养基以保持相同的处理条件，培养基事先恒温箱37℃水浴，以减少对细胞的损伤。

1.2.3 测定的指标及方法 分组干预结束后，用荧光素酶法检定细胞ATP含量，分别用2.8 mmol/L和16.7 mmol/L葡萄糖各刺激INS-1细胞1 h，收集上清后放免法测定其胰岛素分泌水平，分别作为基础和高糖刺激下胰岛素释放，计算高糖刺激胰岛素分泌/基础胰岛素分泌作为胰岛素分泌能力结果。结果均以胰岛细胞总蛋白校正。

1.3 统计学方法

数据用SPSS 13.0统计软件进行处理，计量资料数据以均数±标准差（）表示，采用方差分析，各组内均数比较采用单因素方差分析 (One-way ANOVA)，若方差不齐采用Welch近似方差分析；多重比较采用LSD法（Least-significant difference test），两两比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度葡萄糖及抗氧化剂对INS-1细胞胰岛素分泌水平的影响

六组基础胰岛素分泌（2.8 mmol/L葡萄糖刺激）差异无统计学意义（P＞0.05），高糖刺激胰岛素分泌（16.7 mmol/L葡萄糖刺激）差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 六组INS-1细胞的基础胰岛素分泌及高糖胰岛素分泌(，n=5）

表1 六组INS-1细胞的基础胰岛素分泌及高糖胰岛素分泌(，n=5）

组别基础胰岛素分泌（2.8 mmol/L葡萄糖刺激）（μU/μg protein)高糖刺激胰岛素分泌（16.7 mmol/L葡萄糖刺激）（μU/μg protein)正常糖组高糖组波动组NAC+正常糖组NAC+高糖组NAC+波动组F值P值6.21±0.73 5.89±1.18 5.85±1.04 6.12±0.84 5.93±0.84 6.03±0.89 0.115 0.988 22.91±2.18 16.55±2.13 12.73±2.48 22.41±3.05 19.71±2.01 19.50±2.51 13.365 0

2.2 不同浓度葡萄糖及抗氧化剂对INS-1细胞ATP含量及胰岛素分泌能力的影响

由表2可知，与正常糖组相比，持续性高糖组及波动组的胞内ATP含量及胰岛素分泌能力显著下降（P＜0.01），且波动组下降更明显。使用抗氧化剂NAC干预持续性高糖组及波动组，两组的细胞ATP含量及胰岛素分泌能力均较未使用组显著增加（P＜0.05）。

3 讨论

近年来，血糖波动的危害越来越受到关注，研究发现波动性高血糖不仅促进糖尿病慢性并发症的发生和发展[5-7]，也可损伤β细胞的胰岛素分泌功能[1-2]。本研究发现，波动性高糖及持续性高糖均可损伤INS-1细胞的胰岛素分泌能力，且波动性高糖更严重。

已有研究发现，胰岛β细胞胰岛素分泌与ATP合成相偶联[3-4]。葡萄糖刺激胰岛素分泌的重要机制是葡萄糖增加ATP的合成，减少游离二磷酸腺苷，导致ATP敏感性K+通道关闭，细胞去极化，Ca2+通过钙电压门控通道内流，并产生一系列的级联放大效应使胰岛素分泌颗粒胞吐，胰岛素分泌到细胞外[4]。本研究结果发现，ATP含量在持续性高糖组及波动组均较正常糖组显著下降，且波动组下降更明显。本研究提示，波动性高糖及持续性高糖可能通过降低INS-1细胞的ATP生成降低其胰岛素分泌能力，且波动性高糖更严重。

表2 六组INS-1细胞ATP含量及胰岛素分泌能力的比较（，n=5）

表2 六组INS-1细胞ATP含量及胰岛素分泌能力的比较（，n=5）

注：与正常糖照组比较，■P＜0.01；与持续高糖组比较，▲P＜0.05；与波动组比较，◆P＜0.01

组别 ATP含量 胰岛素分泌能力（nmol/mg protein） （高糖/基础）正常糖组47.058±4.5353.702±0.277持续高糖组35.950±3.911■2.843±0.251■波动组28.816±3.772■▲2.188±0.265■▲NAC+正常糖组48.014±5.0183.668±0.214 NAC+持续高糖组41.624±3.543▲3.342±0.178▲NAC+波动组41.042±3.794◆3.246±0.195◆

高糖可引起胰岛β细胞功能紊乱，胰岛素分泌功能受损，其机制较复杂。近年来大量文献证实氧化应激在β细胞的损伤中发挥的重要作用[8]。胰岛β细胞系INS-1细胞株表达氧自由基清除酶少，对氧化应激损伤高度敏感，本实验采用该细胞株进行研究。已有多篇文献证实抗氧化剂NAC能够保护胰岛β细胞的分泌功能[9]，本研究用NAC处理后发现，NAC+波动组及NAC+持续高糖组的细胞ATP含量及胰岛素分泌能力分别较波动组及持续高糖组显著增加，抗氧化剂可以显著改善细胞ATP及胰岛素分泌能力，提示波动性高糖及持续性高糖导致ATP合成减少可能与氧化应激有关。

综上所述，波动性高糖及持续性高糖可能通过氧化应激使ATP合成减少，且波动性高糖的程度更严重，最终导致INS-1细胞胰岛素分泌功能的损伤。这为以后改善ATP合成以减少β细胞高糖毒性提供更多的理论依据。但波动性高糖及持续性高糖使ATP合成减少的许多具体机制仍未证实，有待进一步的研究。

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