Prohibitin rs6917 C＞T基因多态性与潮汕女性乳腺癌易感性的关系研究

彭 琳 陈建良 方裕森 吴库生 霍 霞

1.汕头大学医学院附属肿瘤医院检验科，广东 汕头 515031；2.汕头大学医学院，广东 汕头 515041

乳腺癌作为女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率正呈逐年上升趋势，在大城市的发病率甚至超过宫颈癌，跃居女性恶性肿瘤首位。1996～2003年，在我院恶性肿瘤住院病例前五位中，乳腺癌是唯一女性恶性肿瘤[1]，汕头地区2005年的统计资料显示，本地区已婚妇女乳腺癌检出率是47.40/10万[2]。乳腺癌的发病机制复杂，其中遗传因素约占发病病因的1/4，基因遗传变异和多态性被认为是肿瘤易感性的重要分子基础。

Prohibitin（PHB/PHB1）被认为是一个候选肿瘤抑制基因，1992年日本Sato等首先提出该基因变异可能与散发性乳腺癌有关[3]。2001年一份北美人群的调查显示，PHB基因rs6917 C＞T单核苷酸多态性 （single nucleotide polymophism，SNP）与乳腺癌遗传易感性存在关联[4]；然而随后其他源自不同国家、不同种族的研究报道结论不尽一致。迄今为止，尚无中国汉族女性的相关报道[5]。本研究将采用高分辨率熔解曲线（HRM）技术进行病例-对照研究，探讨PHB rs6917位点SNP与潮汕女性乳腺癌发生风险的相关性。

1 材料与方法

1.1 对象

231例乳腺癌病例为2009年7～12月在我院住院诊治的患者，均有病理确诊报告，且排除同时合并宫颈癌、卵巢癌及其他恶性肿瘤。对照组169例为同期征集的健康体检正常人群。所有对象要求均为潮汕籍汉族女性，无吸烟史。231例乳腺癌患者平均年龄（49.60±10.71）岁，169例正常对照组平均年龄为（49.06±14.19）岁，经统计学检验，差异无统计学意义（P=0.088）。

1.2 实验方法

在获得知情同意后，采集乳腺癌患者及对照组人员2 mL外周血，以EDTA抗凝。采用TIANamp血液基因组DNA提取试剂盒 （天根生化科技有限公司）提取DNA。将提取好的DNA终浓度调节至10 ng/μL。PCR引物使用Lightscanner Primer Design Software设计，序列为5’-CCAGGAACGTAGGTCGGACAC-3’（上游）和 5’-GCTGAACATGCCTGCCAAAGA-3’（下游），由苏州为真生物医药科技有限公司合成。Taq酶、dNTP购自Roche公司，荧光染料购自Biotium，96孔板、384孔板、封膜等购自汉爵克斯，使用LightCycler480实时荧光定量PCR仪（德国罗氏公司）。PCR反应体系10 μL，含10×PCR Buffer（15 mmol/L MgCl2）1 μL，MgCl2（25 mmol/L）1 μL，dNTP（10 mmol/L）0.25 μL，20×Eva-green 饱和染料 0.5 μL，10 μm Primers各 0.25 μL，PCR 产物（10 ng/μL）1.0 μL、Taq 酶（5 U/μL）0.1 μL，ddH2O 5.65 μL。 反应条件：95℃预变性 5 min，95℃变性 10 s，60℃退火 15 s，72℃延伸 25 s，循环数 50。 扩增结束后直接进行 HRM，反应条件：95℃ 1 min，40℃ 1 min，溶解曲线从65～95℃，温度上升速率为0.02℃/s，每秒检测荧光40次，最后40℃冷却10 s。运行Gene scanning程序，得到分型图谱。对于多态性的基因分型结果，选取10%样本进一步测序验证。PCR扩增曲线及基因型分型图见图1、2。

图1 PCR扩增曲线

图2 HRM分型图

1.3 统计学方法

用SPSS 17.0进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间年龄比较采用 t检验，Logistic回归分析计算优势比（odds ratio，OR）及其 95%可信区间（confidence interval，CI）。

2 结果

2.1 遗传平衡检验

对照组的rs6917 C＞T位点基因型经过Hardy-Weinberg遗传平衡检验，P值符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（P=0.880），说明该人群基因型频率处于平衡状态，具有群体代表性。

2.2 PHB rs6916 C＞T位点基因型分布与乳腺癌易感性的关系

所有受检对象均未发现TT基因型携带者。乳腺癌组C和T等位基因频率分别为0.872和0.128，正常对照组C和T等位基因频率分别为0.864和0.136。经Logistic回归分析，C/C基因型与T/C基因型携带者在乳腺癌发病风险上差异无统计学意义（P=0.706）；在调整了年龄因素后，同样未发现基因型与乳腺癌易感性有关联（P=0.906），见表1。

3 讨论

PHB基因定位于人染色体17q21，与已知的乳腺癌易感基因BRCA1相邻。PHB具有增殖抑制作用，但与蛋白编码区无关，而受控于该基因的3'-UTR。PHB基因的3’UTR存在一个功能性SNP——1630C/T（rs6917），当该位点上的胞嘧啶（C）转变为胸腺嘧啶（T）时，PHB失去增殖抑制作用，细胞永生化生长。进一步研究发现，UTR/C基因型能编码功能性RNA，而UTR/T基因型编码的RNA没有活性，前者对肿瘤细胞增殖及移植瘤生长发挥显著的抑制作用，可将细胞周期阻断在G1/S[6]。

2001年，Jupe等[4]发表在LANCET的一篇报道首次关注PHB基因3'-UTR多态性与家族性、早发性乳腺癌的相关性。该研究通过对北美人群rs6917位点SNP分子流行病学调查发现，T等位基因型与具有一级亲属家族史的乳腺癌患者显著相关（OR=2.5），同时，这种相关性在50岁前被诊断为乳腺癌人群中尤为明显（OR=4.8）。然而随后针对澳大利亚、英国及土耳其等人群的研究却未能得出相同结论[7-9]。来自波兰多中心研究的新近报道则指出，T等位基因型能增加BRCA1基因突变携带者罹患乳腺癌的风险[10-11]。

中国汉族女性PHB基因rs6917位点的基因多态性是否也是乳腺癌的易感因素之一，目前并无相关文献报道。因此，本研究首次利用高通量HRM-SNP技术对潮汕汉族女性PHB基因rs6917位点进行基因多态性检测，结果发现本地区女性仅存在T/C和C/C两种基因型，缺乏T/T基因型，T等位基因频率低于可检索到的其他种族人群T等位基因频率为0.2的平均水平。由于病例组中仅发现4例有一级亲属罹患乳腺癌，故在本研究中未将该因素列入考虑。本次研究的数据表明，T/C和C/C两种基因型在乳腺癌发病风险度上差异无统计学意义，可见，PHB基因rs6917 C＞T多态性并非潮汕人群乳腺癌的易感因素之一。

事实上，PHB基因3'-UTR上还有若干SNP位点，包括rs1049620、rs4987083、rs9893420等，但目前针对乳腺癌易感性的研究多集中在rs6917这一位点上。笔者下一步的工作将对其他位点的基因多态性与乳腺癌相关性进行筛选，翼以寻找可用于筛选乳腺癌易感个体的遗传标志物。

表1 PHB rs6917 T＞C多态性和乳腺癌发病危险关系的Logistic回归分析

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