亲和层析纯化重组中性粒细胞激活蛋白

丁亚骏，何璐云，王亚楠，张亚娟，康巧珍

(郑州大学生物工程系 河南郑州 450001)

中性白细胞和单核细胞的浸润往往会伴随着幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)在人的胃黏膜定植而产生，中性白细胞浸润与胃黏膜损伤程度有一定的相关性。在H.pylori的水抽提物中含有一种能趋化并激活白细胞的成分，称为中性白细胞激活蛋白(neutrophil-activating protein，NAP)［1-4］。几乎在所有 H.pylori菌株中都含有编码HP-NAP的基因HP-napA，Satin等［5］提出NAP是H.pylori的主要毒力因子并且可以作为疫苗研究中的免疫保护性候选抗原。目前HP-NAP在H.pylori免疫反应中的作用正在逐步的研究与探索之中。但从H.pylori菌株中直接大规模纯化这一组分存在一定难度。随着研究深入传统的纯化方法无法满足科研需求。如今科研工作者从与大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein，MBP)融合表达 HP-NAP工程菌 E.coli TB1(pMAL-c2X-napA)中快速高效分离纯化重组融合蛋白。然而以往对rMBP-NAP的分离纯化大多采用FPLC分子排阻层析法，该方法廉价，但伴随的是提取蛋白浓度、纯度有限，且耗时较长、消耗精力较大，无法满足后期实验对该蛋白的质与量上的需求。本实验采用直链淀粉树脂亲和层析法对rMBP-NAP进行分离纯化，快速分离纯化出高浓度、高纯度的融合蛋白rMBP-NAP，为HP-NAP的疫苗研究等后续实验提供材料。

1 材料与方法

1.1 工程菌及主要试剂 基因工程菌 E.coli TB1(pMAL-c2X-napA);直链淀粉树脂层析柱。

1.2 rMBP-NAP的诱导表达 挑取工程菌单菌落接种于氨苄青霉素培养液中，37℃ 200 r/min过夜培养，取菌液接种于丰富培养基中(含氨苄)，37℃ 230 r/min振荡培养至对数生长期，加入诱导剂IPTG至终度浓度0.3 mmol/L，继续培养 3 h。取菌液 200 μL 离心，10%分离胶(SDS-PAGE)检测诱导表达效果。

1.3 菌体的收获及超声破碎 IPTG诱导后的培养物分装于离心管，4℃ 4 000 g离心20 min，弃上清，用5 ml过柱缓冲重悬沉淀，－20℃冻存过夜，室温解冻，于冰水浴中300 W 短脉冲超声破碎(超声5 s，间隔15 s，重复20次左右)至菌液透明。4℃ 9 000 g离心30 min，转移上清，分别取超声上清和沉淀行 SDSPAGE，分析融合蛋白rMBP-NAP的可溶性。

1.4 SDS-PAGE 凝胶图像分析仪照相。

1.5 亲和层析分离纯化rMBP-NAP

1.5.1 亲和层析柱的制备:将直链淀粉树脂灌入层析柱。以8倍柱子体积的过柱缓冲液(20 mmol Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA)平衡柱子。

1.5.2 超声上清过柱:超声破碎并离心后所得的上清，用过柱缓冲液稀释(1∶5)，以1 mL/min的速度使液体通过亲和层析柱。

1.5.3 杂蛋白的去除:用12倍柱体积的过柱缓冲液冲洗亲和层析柱。

1.5.4 洗脱rMBP-NAP:用含有浓度为10 mmol/L麦芽糖的过柱缓冲液洗涤柱子，用5 mL灭菌离心管收集洗脱液，每管3 mL，共收集20管。SDS-PAGE检测每管洗脱液中的蛋白成分。

1.6 rMBP-NAP浓度测定 蛋白质定量试剂盒(普利莱基因技术有限公司)检测蛋白浓度。

1.7 rMBP-NAP纯度检测 使用 ImageJ(version 1.44p)检测融合蛋白纯度。

2 结果

2.1 SDS-PAGE检测IPTG诱导表达效果 rMBPNAP相对分子质量约57 kD与预期结果一致。IPTG成功诱导工程菌E.coli TB1(pMAL-c2X-nap)表达融合蛋白rMBP-NAP，见图1。

图1 IPTG诱导基因工程菌E.coli TB1(pMAL-c2X-napA)表达rMBP-NAP

2.2 SDS-PAGE检测 rMBP-NAP融合蛋白可溶性 E.coli TB1(pMAL-c2X-napA)诱导表达的rMBPNAP主要以可溶性形式存在于超声上清中，相对分子质量约为57 000，与预期结果一致，见图2。

图2 IPTG诱导基因工程菌E.coli TB1(pMAL-c2X-napA)表达融合蛋白rMBP-NAP的可溶性检测

2.3 SDS-PAGE检测rMBP-NAP亲和层析效果IPTG诱导的基因工程菌 E.coli TB1(pMAL-c2X-napA)超声上清，用直链淀粉树脂亲和层析柱纯化，洗脱液进行SDS-PAGE检测，见图3。

图3 SDS-PAGE检测重组蛋白rMBP-NAP直链淀粉树脂亲和层析效果

2.4 rMBP-NAP蛋白浓度测定 参照蛋白定量试剂盒说明书，酶标仪于570 nm波长测量吸光度值并绘制标准曲线。融合蛋白rMBP-NAP吸光度OD570=0.64，根据标准曲线得出蛋白浓度为625 μg/mL，见图4。

图4 蛋白质定量试剂盒检测rMBP-NAP蛋白浓度

2.5 融合蛋白rMBP-NAP纯度检测 亲和层析纯化后的rMBP-NAP融合蛋白经SDS-PAGE检测后，利用软件ImageJ(version1.44p)根据SDS-PAGE照片绘图计算蛋白纯度。软件计算得出rMBP-NAP纯度为96.78% 。

3 讨论

以往的实验研究中，获取rMBP-NAP采用的是快速蛋白液相层析色谱法(FPLC)，是运用快速蛋白纯化全自动色谱系统来进行分离纯化。该方法效率较为优越，灵敏度高(可达到10－9g/ml数量级)，洗脱过程梯度变化，洗脱效果好。但是，FPLC方法在实行的过程中，需要有专业的人士来操纵快速蛋白液相分析系统进行实验，对实验条件和实验人员要求较高。本实验应用直链淀粉树脂，对IPTG诱导工程菌表达的重组蛋白rMBP-NAP直接进行亲和层析，实现了一步纯化。该方法操作简便，实验周期短，纯化得到的rMBP-NAP具有较高浓度和纯度，可满足科研的需要。同时，与HP-NAP融合表达的麦芽糖结合蛋白(MBP)不仅可用于亲合层析，还有商品化的MBP抗血清，可用于免疫反应跟踪鉴定实验结果。这对一种新的重组蛋白的鉴定尤为重要。

有报道，应用FPLC分子排阻层析法分离的rMBPNAP 的纯度为 91% ，含量为 0.121 g/ml［8］。本实验结果表明，直链淀粉树脂亲和层析法分离纯化rMBPNAP无论是从效率上还是纯度上都优于FPLC分子排阻层析法。因此，应用直链淀粉树脂亲和层析法可更快更好地分离纯化融合蛋白rMBP-NAP，为HP-NAP的疫苗研究等后续实验提供材料。

［1］周永宁，徐采朴.幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋白的研究进展［J］.免疫学杂志，2001，17(3):53-55.

［2］康巧珍，段广才，范清堂，等.幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋白与麦芽糖结合蛋白融合表达产物rMBP－NAP的分离纯化［J］.郑州大学学报(医学版)，2004，39(5):746-749.

［3］Qiao-Zhen Kang，Guang-Cai Duan，Qing-Tang Fan，et al.Fusion expression of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein in E.coli［J］.World J Gastroenterol，2005，11(3):454-456.

［4］Gaia Codolo，Paola Mazzi，Amedeo Amedei，et al.The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori down－modulates Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma［J］.Cellular Microbiology，2008，10(11)，2355-2363.

［5］Satin B，Del Giudice DG Della，Bianca DV，et al.The neutrophilactivating protein(HP-NAP)of Helicobacter pylori is a protective antigen and a major virulence factor［J］.J Exp Med，2000，191(9):1467-1476.