Leber病14484原发合并新继发位点突变频谱研究

安慧娟，张艳敏，宋 丹，孙艳艳，杨 旭，鲍玉洲

(1.郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室 河南 郑州 450001;2.河南中医学院第二附属医院检验科 河南郑州 450002;3.河南省眼科研究所分子生物室 河南 郑州 450003)

Leber遗传性视神经病变(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)是一种主要累及视网膜、巩膜筛板前部视乳头黄斑束纤维，导致视神经变性的临床常见母系遗传性线粒体疾病，临床主要表现为急性或亚急性中心视力的丧失，常累及青年男性［1－3］。传递方式不符合孟德尔遗传规律［4］。根据线粒体DNA突变位点在LHON致病的影响程度，将其大致分为原发性突变和继发性突变。近年来，随着分子生物学基因诊断技术的发展，新的继发位点不断被发现。本研究针对我室筛选出的LHON14484原发位点突变先证者的NADH脱氢酶亚基6基因(ND6)区进行测序，检测ND6区是否存在其他新的继发位点，继发位点是否对原发位点有影响，探讨14484患者合并ND6区域继发突变的特点及其规律。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集了57例2008年12月至2011年5月河南省人民医院眼科门诊与住院病人，经PCR检测确证为LHON患者。临床诊断有典型的LHON表现，所有患者均表现为急性或亚急性双眼同时或先后视力下降，不伴眼疼，并且均经头颅CT或/和核磁共振成像(MRI)、血液学及眼科相关检查，视野检查，中央视野缺损，VEP、ERG检查T波下降等排除其他视神经病。其中男43例，女14例，男:女 =3.1∶1，年龄14～47岁，平均年龄23.4岁。随机抽取20名视力及眼部检查正常、无家族遗传史的健康对照者。其中男12名，女8名，年龄12～35岁，平均年龄21.7岁。

1.2 试剂和仪器 血液细胞基因组DNA提取试剂盒为北京明日百傲公司产品，所用PCR试剂、DNA分子量标记、琼脂糖凝胶和溴化乙啶等均为大连宝生物公司产品。2720型PCR扩增仪为美国ABI公司。BccⅠ内切酶为NEB公司产品。其他试剂均为国产或进口分析纯以上级。

1.3 检测方法

1.3.1 临床标本及处理:抽取临床LHON T14484C疑似患者外周血2 ml，枸橼酸钠抗凝，经0.9%NaCl溶液对倍稀释后，缓慢加入装有4 ml淋巴细胞分离液的离心管中，2 500 r/min×10 min，吸取中间有核细胞层，置于1.5 ml离心管内，离心5 000 r/min×5 min，弃上清液，沉淀即为有核细胞。

1.3.2 DNA提取:用北京明日百傲血液细胞基因组DNA提取试剂盒，参照说明书的方法提取外周血白细胞中DNA。

1.3.3 PCR扩增:PCR扩增长度为224个碱基对。引物的序列分别为:5’-AACCCCACTAAAACACTCAC-3’(14387-14406);R:5‘-AAGCCTTCTCCTATTTATGG-3’(14610-14591)。反应总体积为 25 μl，其中包括:10 × PCR 缓冲液 2.5 μl，10 mmol/L dNTPs 0.5 μl，10 μmol/L 的上游和下游引物各0.5 μl，2 U/μl的 Taq DNA 聚合酶 0.5 μl，模板 DNA 2 μl。PCR 扩增条件为预变性94℃8 min;94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，5个循环;94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环;最后72℃延伸5 min;扩增目的片段产物经纯化后BccⅠ37℃ 3 h酶切，12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结果银染。

1.3.4 SSCP: 取 10 μl酶切后的 PCR 产物，加入 10 μl变性剂混匀后上样，300 V电压下电泳5 min，然后在120 V电泳3 h，取下凝胶，进行硝酸银染色判定结果。

1.3.5 DNA序列测序:测序由华大基因公司完成，测序结果与剑桥大学Sangon研究所基因文库标准序列进行比对。

2 结果

2.1 继发突变分析 在57例疑似LHON病例中，用聚合酶链反应－单链构象多态性(PCR－SSCP)和聚合酶链反应－限制性片段长度多态性(PCR－RFLP)检测出9例14484原发位点突变(图1)，占15.8%，男6例，占66.7%，女3例，占33.3%。将这9例14484阳性的PCR产物测序，结果显示，2例为单纯性14484原发位点突变(图2b)，占22.2%，均为男性;3例14484原发位点合并14502继发位点突变，占33.3%(图2c)男1例，女2例，3例14484位点合并14470位点突变，占33.3%(图2d)，男2 例，女1 例，1例14484位点合并14569位点突变(图2e)，占11.1%，为男性。

图1 SDS－PAGE电泳结果分析

图2 线粒体基因测序结果分析

2.2 酶切后电泳片段结果分析 PCR扩增产物直接琼脂糖水平电泳，无论正常人还是单纯14484原发位点突变或合并继发位点突变，扩增片段长度均为224 bp。用BccⅠ酶切后结果显示，正常人可分别出现121，76和27 bp3条片段，由于27 bp片段太小，仅能看到121和76 bp的两条片段;14484突变者无论是单纯性原发突变还是同时有继发突变存在，酶切后均可出现148和76 bp两条片段(图1)。

3 讨论

Leber遗传性视神经病变是一种母系遗传的线粒体疾病，好发于青年男性，以双眼急性、亚急性视力下降为特征。1871年德国眼科医生Leber首次对该病进行了报道。1988年美国的Wallace等提出LHON与线粒体第11778突变位点相关，迄今已发现50多种线粒体突变位点与LHON致病位点相关，其中超过95%的患者与 G11778A、G3460A、T14484C 3个突变位点有关［5］，因此这3个位点突变被认为是原发性突变，其单独存在可以致病。部分LHON相关的其他mtDNA突变在正常人群中也有出现，这些突变被称为继发突变，能增加特定人群患LHON的风险，并且能在携带原发突变的个体中起协同作用，增加LHON的外显率及表现度［6］。目前对LHON的确认主要采用分子生物学的方法，其中包括等位基因多重PCR(multiple allele specific-PCR，MAS-PCR)，限制性片段长度多态性 PCR(reaction fragment length polymorphism-PCR，RFLPPCR)，单链构象多态性PCR(single strand conformation polymorphism-PCR，SSCP-PCR)，序列测定及 MGB探针PCR法等。不同的检测方法，各自的功能及特点也有所不同。测序结果虽然被认为是鉴定突变的金标准，但出结果慢，费用高，目前在我国仅限于科研，尚不适合临床样本的大规模筛查。MGB探针PCR法检测位点突变虽然结果精确，但是需要构建质粒，建立标准曲线，根据野生型和突变型的比值来判定结果，缺乏直观性，且操作复杂，价格昂贵。本研究综合采用了以上各种检测方法，分析并利用以上各种方法的特点及各自长处对LHON进行了分析研究。MAS-PCR检测方法具有操作简单、出结果快、对实验条件要求不高，费用低等优点，因此比较适合用于临床检测。

人线粒体DNA(mtDNA)为全长16 569 bp的双链闭环分子，编码与氧化磷酸化功能密切相关的13条呼吸链酶复合体的多肽链及表达这些基因组所必须的22个tRNAs和2个rRNAs。mtDNA参与编码的13个亚基分别为复合物Ⅰ(NADH－CoQ还原酶)的7个亚基单位(ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6);复合物Ⅲ(CoQ－CytC还原酶)的一个亚单位(Cyt－b)，复合物Ⅳ(CyktC氧化酶)的3个亚单位(COⅠ、COⅡ、COⅢ)和复合物Ⅴ(ATP合酶)的2个亚单位ATP复合酶6和8，这些蛋白质组成呼吸链和ATP酶复合物成分均位于线粒体内膜中［7］。在目前已经公布的59个原发和继发位点当中，ND1区(3 307～4 262 bp，共包含956 bp)突变位点有13个，占22%(13/59)，ND6区(14 149～14 673 bp，共包含525 bp)突变位点有10个，分别为 T14484C、C14482G/A、G14459A、C14498T、C14568T、A14595G、G14279A、T14325C、T14502C、A14596T，占17%(10/59)，但是ND6区所包含的核苷酸比ND1区短400多个bp，如果只考虑突变位点在本区域内所占的比例ND1区突变占1.4%(13/956)，ND6区占1.9%(10/525)，ND6区是mtDNA编码的13个亚单位中突变率最高的，这也正是我们选取这一区域进行研究的目的所在。本研究中，被临床诊断为LHON排除11778和3460两个原发突变位点的先证者共57例，9例存在14484位点突变，其中2例为单纯性14484原发位点突变，3例14484原发位点联合14502继发位点突变，3例14484位点联合14470继发位点突变，1例14484位点联合14569继发位点突变，而正常对照组当中均未发现这些位点存在突变。相比较于前面已经报道的ND6区的突变位点，我们又发现了14470和14569这两个新的继发突变位点。本研究中14484突变位点在LHON患者中所占的比例为15.8%，相比较于郭向明等［8］统计14484位点在我国占5.7%，随后隋桂琴等［9］对14484位点的筛查率为4.8%，日本占9%［10］，这一突变比例明显偏高，这可能与种族和地区差异有关，也可能与我们选取的样本有关。我们选取的9例样本中，包括2个家系，1个为姐弟2人，另1为母子2人。这两个家系中，女性携带者均不发病，男性患者发病较急，视力下降较快，经过6个月的治疗，视力已基本恢复。经观察愈后症状明显比11778 和 3460 患者轻，这与 Johns［11］及 Mashima［12］等报道的基本一致。

LHON是最为常见的线粒体遗传病，可最终导致失明。影响LHON发病的致病机理到目前还没有统一的认识，但是抽烟、酗酒、紫外线过度暴露、核基因的修饰调节及环境因素等对其发病有一定的影响。因此在对视神经萎缩症患者的诊断过程中，了解患者的家系背景，使用基因检测的方法对目的位点进行检测，将有助于提高诊断的正确性，对有明显性别遗传倾向的家系，临床上医生可以建议选择性生育，这将有利于降低LHON的发病率，同时也为LHON的预防和早期治疗，提高出生人口的素质提供帮助。

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