人牙周膜干细胞的分离鉴定及骨形态发生蛋白-2对其趋化效应的研究

杜令倩 杨丕山 赵宁 葛少华

（1.山东大学口腔医院 牙周科；2.山东大学第二医院 牙周科；3.山东省口腔生物医学重点实验室，济南 250012）

牙周炎可导致牙周附着丧失、牙槽骨破坏和吸收。牙周病治疗的主要目标是获得牙周组织再生[1]。牙周组织再生性治疗的效果很大程度上依赖于病损局部残留的牙周再生性细胞的数量和质量，然而由于长期慢性炎症的影响，病损区域牙周再生性细胞的数量不足、功能不佳。如何获取足够的牙周再生性细胞是牙周病治疗的关键[2]。从人牙周膜组织中分离的人牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）具有自我更新的能力并有多向分化潜能，在适当的培养条件下能分化为成牙骨质样细胞、成骨细胞、脂肪细胞和胶原形成细胞，并且在动物牙周缺损模型中能够引起牙周膜组织的再生和牙槽骨高度的恢复[2-3]，因而被认为是牙周组织再生的主要功能细胞。

牙周组织再生过程的关键是有足够量的功能细胞迁移到组织缺损区域，发挥干细胞作用，重建牙周组织。骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）是目前在牙周组织再生工程中研究和应用最多的多肽生长因子之一[4]。其能够促进牙周膜细胞的增殖及胞外基质蛋白的合成，能够促进牙周膜干细胞的成骨分化和骨形成[5]，诱导牙槽骨再生。目前关于BMP-2对PDLSCs的趋化效应却知之甚少。为此，本研究旨在观察人PDLSCs对BMP-2的趋化反应。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

高糖DMEM培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Hyclone公司，美国），Ⅰ型胶原酶、DispaseⅡ、胰蛋白酶（Gibco公司，美国），双抗、PBS液、地塞米松、维生素C、β-磷酸甘油钠、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、牛胰岛素（上海Solarbio生物科技有限公司），70μm筛网（Falcon公司，美国），波形丝蛋白抗体、角蛋白抗体（武汉博士德生物工程有限公司），5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）（Sigma-Aldrich，St Louis，MO，美国），BrdU抗体、BMP-2（Santa Cruz公司，美国），FITC荧光标记二抗、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（北京中杉金桥生物科技有限公司），各型号培养板、培养瓶、冻存管、离心管（Corning Costar公司，美国），其他试剂均为国产分析纯级。

GBB16CO2紫外清洁型培养箱（Heraeus公司，德国），DL-CJ-IN型高性能超净工作台（哈尔滨市东联电子技术公司），IXZ-ILL100型倒置相差显微镜、OLYMPUS荧光显微镜和成像系统（OLYMPUS公司，日本）。

1.2 实验方法

1.2.1 分离和培养人PDLSCs 标本的取得遵守世界医学协会WMA《赫尔辛基宣言》所阐述的原则，经山东大学医学院医学伦理委员会批准，并获取患者及监护人的知情同意。标本取自临床上12～14岁因正畸治疗而拔除的牙周健康、无龋的新鲜前磨牙，刮取根中1/3的牙周膜组织，移入离心管中，加入3 g·L-1Ⅰ型胶原酶和4g·L-1DispaseⅡ轻轻振荡，37℃下消化1h，通过70μm筛网获得单个离散的细胞。将细胞密度调整为每毫升1×104个，接种于含高糖DMEM培养基的10 cm培养板中，培养基中含10%FBS、2mmol·L-1L-谷氨酰胺、l00U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1链霉素，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。3 d后换入新鲜培养液，以去除未贴壁的细胞，以后每2 d换液一次。取对数生长期的第一代细胞，调整细胞密度为每毫升10～15个，吹打混匀后接种于96孔培养板中，每孔100μL，培养12 h后标记单个细胞孔并补液至每孔200μL，5 d后换液，待克隆长至孔底1/3～1/2后胰酶消化，扩大培养。

1.2.2 免疫荧光染色鉴定人PDLSCs的来源 将传代后的人PDLSCs细胞爬片后进行免疫荧光染色。4%多聚甲醛室温固定30min，10%山羊血清37℃封闭30min后分别滴加适量稀释后的鼠抗人角蛋白（1∶400）、鼠抗人波形丝蛋白（1∶400）、鼠抗人STRO-1单克隆抗体（1∶500），以PBS代替一抗作阴性对照，置于湿盒中4℃过夜。次日在37℃，避光孵育lh，加入FITC荧光标记二抗，避光孵育1 h，并用5μg·mL-1DAPI复染核5min，检测角蛋白、波形丝蛋白和STRO-1的表达，由于现在未发现PDLSCs特异表面标志物，目前干细胞表面抗原STRO-1被用来分离和鉴定PDLSCs[6]。

1.2.3 PDLSCs多向分化能力的检测 将细胞以密度为每孔8×103个接种于96孔板，培养24 h后，加入成骨诱导剂（0.1 μmol·L-1地塞米松、50mg·L-1维生素C、10mmol·L-1β-磷酸甘油钠）或成脂诱导剂（0.25μmol·L-1地塞米松、50μmol·L-1吲哚美辛、0.5mmol·L-1IBMX、10mg·L-1牛胰岛素），对照组为不含诱导剂的培养基。每周换液2次，4周后分别用茜素红钙盐染色法及油红O染色法来测定PDLSCs的多向分化能力。

1.2.4 PDLSCs克隆形成能力及增殖活性的检测 为检测PDLSCs的克隆形成能力，将传代后的PDLSCs以密度为每孔1 000个细胞接种于6孔板中，培养10 d后，PBS冲洗2次，100%甲醇固定5min后，0.1%Toluidine blue染色，多于50个细胞的细胞集落为一个克隆。

为检测PDLSCs的增殖状态，将传代后的PDLSCs按每毫升3×104个接种于含盖玻片的6孔培养板内，当细胞长至60%融合时，换液后每孔各加入10μg·mL-1BrdU，孵育24 h后收集细胞进行BrdU的免疫化学染色。BrdU为胸腺嘧啶的衍生物，它可代替胸腺嘧啶参与DNA的合成，其掺入的多少可直接反应细胞的增殖状况。4%多聚甲醛室温固定30min，2mol·L-1的盐酸37℃孵育30min，10%山羊血清37℃封闭30min后，分别滴加适量稀释后的鼠抗人BrdU单克隆抗体（1∶500），以PBS代替一抗作阴性对照，置于湿盒中4℃过夜。次日在37℃，避光孵育1h，加入FITC荧光标记二抗，避光孵育1 h，并用5μg·mL-1DAPI复染核5min，检测BrdU的阳性细胞占总细胞数的比例，每组实验重复4次。

1.2.5 细胞趋化实验 用多聚碳酸膜上有8μm微孔的24孔Transwell细胞培养室来检测PDLSCs对BMP-2的趋化反应[7]。将第3代PDLSCs调至每毫升5×105个，在细胞培养室的上腔分别加入200μL细胞悬液（含0.01%FBS的高糖DMEM培养基），实验组的下腔分别加入终浓度为100、200 ng·mL-1BMP-2的含0.01%FBS的高糖DMEM培养基500μL。空白对照组下腔中加入含0.01%FBS的高糖DMEM培养基500μL。为证实细胞的迁移效应是由于BMP-2的趋化效应而非细胞的化学运动，消除细胞培养室上下腔中BMP-2的浓度梯度，上下腔中所用培养液均含有200 ng·mL-1BMP-2。所有样本均设有复孔。37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。20 h后用4%多聚甲醛室固定滤膜上下表面附着的细胞20min，用棉签轻轻拭去滤膜上表面的细胞后PBS冲洗。伊红染色滤膜3min，PBS冲洗3次。待滤膜干燥后，采用盲法计数，在倒置相差显微镜下，计已迁移至滤膜下侧面的细胞数，每个滤膜随机观察6个不重叠的高倍视野，每组实验重复4次。

1.3 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件包对数据进行处理。计量资料统计结果以均数±标准差表示，多组样本均数比较采用单因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 PDLSCs的分离和纯化

本实验中原代培养的牙周膜组织来源的细胞形成相互黏附的克隆细胞簇（图1），传代后的PDLSCs呈典型的长梭形，卵圆形细胞核包括2或3个核仁，部分细胞核有明显的分裂相（图2）。

2.2 PDLSCs的鉴定

免疫荧光染色可见，PDLSCs角蛋白呈阴性表达，波形丝蛋白呈阳性表达（图3A），说明本实验中克隆化细胞为中胚层来源的间充质细胞且无外胚层来源的细胞污染。免疫荧光染色证实克隆细胞STRO-1呈阳性表达，细胞发出明亮的红色荧光，细胞核发出蓝色荧光（图3B），说明细胞有干细胞特性。

2.3 PDLSCs向成骨细胞和成脂细胞分化

PDLSCs经成骨诱导剂诱导4周后，茜素红钙盐染色显示红色的矿化结节（图4A），矿化结节散在分布，周边界限不清，周围见PDLSCs，生长中心处结节较多。经成脂诱导剂诱导4周后，油红O染色显示细胞内出现密集的脂滴（图4B），PDLSCs向脂肪细胞分化。

2.4 PDLSCs的克隆形成能力和增殖率

克隆形成实验结果显示：传代后的人PDLSCs能够形成克隆细胞簇（图5），镜下观呈克隆状生长的PDLSCs呈长梭形，细胞体积较小，排列紧密；克隆中心部细胞界限不清，呈长梭形或形状不规则；周边部分细胞呈多角形或纤维状。BrdU免疫细胞化学染色阳性率接近100%，说明PDLSCs对BrdU有较高的摄取率，即PDLSCs有较高的增殖能力（图6）。

2.5 BMP-2对人PDLSCs的趋化效应

在不同浓度下，PDLSCs对BMP-2显示不同的趋化反应。在100、200 ng·mL-1BMP-2实验组，PDLSCs迁移至膜下表面的每高倍视野细胞数目分别是（71.33±4.01）、（45.83±3.30）个，细胞数目均明显多于空白对照组的（35.75±2.63）个（P＜0.01）。100 ng·mL-1BMP-2实验组对PDLSCs的趋化效应强于200 ng·mL-1BMP-2实验组（P＜0.01）。在消除细胞培养室上下腔中BMP-2浓度梯度后，迁移至膜下表面的每高倍视野细胞数目为（39.08±2.07）个，明显少于仅下腔中含200 ng·mL-1BMP-2实验组（P＜0.01），说明PDLSCs的迁移是由BMP-2引起的趋化效应而不是PDLSCs的化学运动。

3 讨论

再生性治疗措施，如引导组织再生术[8]、局部应用釉基质蛋白[9]、各种生长因子的应用[4]及干细胞移植[2]等方法，使牙周组织的再生取得了一定的进展。这些治疗方法或通过促进牙周膜中未分化间充质干细胞的不断增殖提高功能细胞的数量，或诱导间充质干细胞分化为成牙骨质细胞、成骨细胞来促进骨形成，或通过改善再生性细胞的功能促进细胞合成胶原、产生相应的蛋白、形成细胞外基质并促进其矿化以修复牙周缺损。然而，从周围组织或血管中募集更多再生性细胞至牙周缺损区可能是牙周组织再生过程中一个更重要的过程。

BMP-2因能够促进未分化间充质干细胞向成骨分化及其在牙骨质和牙槽骨再生中的重要作用而成为牙周再生医学中研究的热点之一。已知BMP-2能够改善PDLSCs的增殖状态，促进其向成骨分化并刺激细胞外基质的产生，诱导牙骨质的形成及牙槽骨的改建来修复牙周缺损[5，10]。然而有关BMP-2对PDLSCs迁移效应的研究较少。在骨创伤愈合和重建过程中，BMP-2作为一种重要的趋化因子，对间充质祖细胞、骨祖细胞、成骨细胞具有募集效应，并且对未分化成骨细胞的募集效应强于分化成熟的成骨细胞[11-12]。在牙周炎治疗过程中表达增高的BMP-2可能也参与对牙周膜中未分化间充质干细胞的募集[13]。因此，设想BMP-2对牙周组织中再生性细胞的募集效应可能是其促进牙周组织再生的另一个机制。Seo等[3]将牙周膜中未分化间充质细胞成功分离出来，并将其命名为牙周膜干细胞。其具有多向分化能力和牙周再生的潜能，是牙周组织再生的主要功能细胞。

本实验发现人PDLSCs对BMP-2具有明显的趋化反应，并证实PDLSCs的迁移运动是由BMP-2引起的趋化效应而不仅是PDLSCs的化学运动。因此，在牙周组织工程中，外源性的BMP-2或者局部表达增高的BMP-2可能参与从邻近组织或血管周围向病损区域募集PDLSCs，这一效应可能是其促进牙周组织再生的重要机制之一。这些细胞不仅能向成骨细胞分化促进骨形成和骨改建，而且可能也为牙周膜组织再生和牙骨质形成提供了更多的功能细胞。

本研究丰富了BMP-2对PDLSCs生物学行为影响的内容，为其促进牙周组织再生提供了新的理论依据。同时也提示，探索能够募集PDLSCs的趋化剂可能为牙周组织再生工程提供新的思路。

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