过量表达甜菜BvNHX1基因提高拟南芥的耐盐性

王 鹏，安 静，，侯 蕾，孔祥强，，赵彦修，张 慧*

(1.山东师范大学、山东省逆境植物重点实验室，山东济南 250014;2.山东省农业科学院，山东济南 250100)

盐胁迫条件首先对植物产生渗透胁迫，植物可以通过增加吸收无机离子来对抗渗透胁迫，但是随着无机离子特别是Na+的大量积累又产生了离子毒害。为了能在盐胁迫环境中生存，植物的一个重要策略就是降低植物细胞质中的Na+含量，建立新的离子稳态。细胞水平上，离子稳态的建立主要包括两方面:Na+的外排和Na+的区隔化［1］。位于液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白 (NHX)通过质子泵水解ATP供能，将胞质中的Na+区隔化至液泡，以消除Na+的毒害，同时促进K+的高亲和性吸收［2］，在盐胁迫下对植物细胞维持稳定的pH值和离子稳态起到重要的作用［3］。

拟南芥、水稻、冰叶日中花等多个物种中的液泡膜NHXs相继被克隆［4］。拟南芥AtNHX1在拟南芥［5］、番茄［6］、棉花［7］中的过量表达，均提高了转基因植株的耐盐性［8］，而通过基因敲除等方法使NHXs活性降低则导致植株耐盐性降低［9］，证实了其在植物耐盐性中的重要作用。拟南芥AtNHX1的表达受盐胁迫诱导，但上调幅度不明显［10］，而冰叶日中花［11］和甜菜 (Beta vulgaris L.)［4］中的NHXs基因则能明显被盐胁迫诱导，同时其表达受ABA诱导途径中的MYB转录因子所调节［12］。Garbarino J等［13］证实甜菜液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白在盐诱导条件下表达量升高，转运活力增强。这些结果显示了盐生植物Na+/H+逆向转运蛋白在植物耐盐机制中的重要性。过量表达甜土植物拟南芥［5］、大豆［14］、水稻［15］和盐生植物碱蓬和盐芥 (引用加上李维焕和高秀华发表的文章)等的NHXs基因都不同程度提高了转基因植物的耐盐性。但是对于甜菜BvNHX1基因的研究却很少。

甜菜是一种中度耐盐的植物，1985年Blumwald等第一次从耐盐植物甜菜的根部贮藏组织液泡膜上发现了Na+/H+逆向转运活性［16］。Xia等获得了编码BvNHX1的cDNA序列，发现盐处理能够提高BvNHX1在整株水平上的表达量，同时能够提高BvNHX1蛋白表达量和Na+/H+转运活性。酵母互补试验证明它能恢复酵母突变体 (Dena1–4Dnhx1)液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的活性［4］。本研究从甜菜cDNA中克隆得到BvNHX1基因，利用植物表达载体pROKII将BvNHX1基因在拟南芥中过量表达，筛选获得了过量表达BvNHX1基因拟南芥的纯合转化子，对其进行了分子鉴定和耐盐性分析，探讨BvNHX1在植物耐盐中的作用。

1 材料和方法

1.1 质粒、菌株和植物

载体pYES2、植物表达载体pROKⅡ、大肠杆菌 (Escherichia coli)DH5α菌株、农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)GV3101菌株、拟南芥 (Arabidopsis thaliana)Columbia生态型种子为本实验室保存。载体pGEM－T Easy Vector购于Promega公司。

1.2 酶与试剂

分子生物学实验用各种限制性内切酶、T4连接酶和Ex taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司，生化试剂购自Sigma公司或国产分析纯。所用DNA引物由上海生工公司合成，用到的引物序列为:BvNHX1F:5＇－ATGAGTTTCTGAGGGTCTGG－3＇;BvNHX1R:5＇－ATATTCTGTCTATCAAATTTTCGG－3＇。

1.3 BvNHX1基因的克隆和植物表达载体的构建

以甜菜cDNA作模板，使用BvNHX1F和BvNHX1R引物通过RT－PCR扩增得甜菜BvNHX1基因，克隆到pGEM－T Easy载体 (由本实验室张荃老师构建，未发表)中。用NotI酶切pGEM－BvNHX1和中间载体pYES2质粒，回收片段，将目的基因片段连入pYES2载体，构建成pYES2－BvNHX1载体。用位于BvNHX1基因577 bp位置的BstXI酶切检测pYES2－BvNHX1中BvNHX1的插入方向，用KpnI和XbaI双酶切pYES2－BvNHX1基因反向插入 (BstXI酶切检测反向插入的pYES2－BvNHX1可切出约1200 bp的条带)的质粒和pROKⅡ质粒，将带有KpnI/XbaI粘性末端的目的片段连入pROKⅡ载体，最终构建成为植物表达载体pROKⅡ－BvNHX1。

1.4 拟南芥转化及Southern和Northern杂交鉴定

通过冻融法将表达载体导入农杆菌GV3101，用花侵染法转化野生型拟南芥。将收获的T0代种子播种在添加40 mg/L卡那霉素的MS培养基上筛选抗性苗，单株收取种子，后代经自交最终获得T3代稳定遗传的纯合转基因植株，用于转基因株系的Southern和Northern杂交鉴定。提取部分转BvNHX1基因的纯系和野生型拟南芥的基因组DNA，用HindⅢ酶切拟南芥基因组DNA，以BvNHX1基因全长片段为探针模板进行Southern杂交。提取部分转BvNHX1基因的纯系和野生型拟南芥的总RNA，以BvNHX1基因全长片段为探针模板进行Nouthern杂交。杂交膜以磷屏 (Kodak)压膜24 h，Typhoon 8600(Molecu-lar Dynamics)扫描磷屏获得杂交结果及信号数据。

1.5 过量表达株系的耐盐性分析

1.5.1 盐胁迫下种子萌发率测定方法 种子消毒除菌后重悬于灭菌水中，用枪吸取种子均匀播种在含有150 mM NaCl的1/2 MS培养基上，每皿播种100粒。4℃层积3 d后放入培养箱培养，每天统计种子萌发率，以有两片绿色子叶为准。

1.5.2 拟南芥成苗的盐处理方法 拟南芥种子播种于育苗介质:蛭石:珍珠岩 (4:3:1)的混合介质中，培养条件是:光照16 h，温度18℃，湿度60%;黑暗8 h，温度22℃，湿度60%。拟南芥生长到4周时，选取长势一致的幼苗，分别用不同浓度NaCl溶液进行浇灌处理，对照浇灌Hogland营养液。NaCl的浓度逐渐增加，每次递加50 mM直到终浓度，每隔1 d处理1次，达到处理终浓度后，再继续处理14 d。每次浇灌量为培养基质持水量的3倍，以保持盆中处理液浓度的恒定。观察各株系的生长情况并拍照。

1.5.3 干、鲜重的测量 将信封编号，放于烘箱中烘干至恒重，记录信封的重量。收取植株地上部分叶片，用蒸馏水冲洗干净，用吸水纸吸干表面水分，迅速装入对应信封中，测每个重复的信封和鲜重的和。之后放入烘箱中，120℃烘烤30 min，再转为80℃烘烤48 h至恒重，称量信封和干重的和。计算单株地上部分的干重和鲜重。每个株系做3个重复，每个重复包含5棵植株。

1.6 Na+、K+离子含量的测定方法

取叶片120℃杀青30 min，于80℃的烘箱烘干2 d，取烘干的材料100 mg于坩埚内，放入马福炉中300℃ 2 h然后560℃ 10 h进行灰化处理，冷却后取出，加入一定量的硝化液 (由1mL 60%三氯乙酸，5 mL浓硝酸和0.5 mL浓硫酸混合而成)，于90℃恒温水浴中保温10 min。空白对照为加入等量硝化液的双蒸水。12000 rpm离心12 min，取上清液。稀释一定的倍数，用火焰分光光度计Flame Photometer 410(Z－8000，Hitachi，Tokyo，Japan) 测定Na+和K+离子的含量［17］。每个分析样本取5株进行测定，重复3次，取其平均值。

2 结果与分析

2.1 BvNHX1基因植物表达载体的构建及酶切验证

将pGEM－－BvNHX1、中间载体pYES2－BvNHX1和植物表达载体pROKⅡ－BvNHX1分别用合适的内切酶进行酶切检测，图1为载体构建过程的酶切验证结果，可见pROKⅡ－BvNHX1和pGEMBvNHX1质粒能酶切出同等长度的目的基因条带 (图1中箭头所指的位置为目的基因条带)，证明BvNHX1基因表达载体构建成功。

2.2 拟南芥转化及抗性植株分子鉴定

用农杆菌花侵染法转化拟南芥，获得了pROKⅡ－BvNHX1的转化植株。选取6个转基因株系进行Southern杂交分析 (图2 A)，以野生型植株的DNA作对照，结果发现转基因植株中都出现了阳性杂交信号，对照没有杂交信号，这表明基因的确已经整合到拟南芥的基因组中，而T－DNA插入的拷贝数不等。对同样的6个转基因株系进行Northern杂交分析 (图2 B)，检测转基因植株中BvNHX1基因的表达情况，结果表明BvNHX1基因在拟南芥中正常转录，野生型拟南芥没有杂交信号。不同转基因拟南芥植株杂交信号强弱不同，表明不同株系BvNHX1的表达量不同，其中b30－3、b19－6、b11－23株系表达水平较高。

2.3 转基因植株的耐盐性分析

为研究BvNHX1转基因拟南芥在高盐条件下的胁迫抗性，将分子鉴定为阳性并且BvNHX1表达量较高的b30－3、b11－23 T3代转基因株系进行耐盐性分析。

2.3.1 转基因植株在盐胁迫条件下的种子萌发情况 为了检测过量表达BvNHX1基因能否提高转基因植株在萌发期的耐盐性将野生型和BvNHX1转基因株系b30－3的种子分别播种在含有150 mM NaCl的1/2 MS培养基上，此后每天计算种子的萌发率。如图3，b30－3比野生型种子萌发早，培养4 d的时候野生型只有极少数种子萌发，而b30－3萌发率达到大约16%，此后BvNHX1转基因株系b30－3每天的萌发率均比野生型明显升高。说明过量表达BvNHX1基因提高了盐胁迫下拟南芥种子的萌发率。(最好加上吧b11－23的数据)

2.3.2 转基因植株在不同盐胁迫处理下的生长情况 将野生型和转基因拟南芥播种于混合介质中，生长4周后，分别用0、100、125、150、和200mM NaCl处理。处理2周后发现，在0 mM NaCl处理下，转基因植株 (b30－3)的生长与对照植株没有明显的差异。而在NaCl胁迫下，野生型和转基因株系的生长均受到影响，处理盐浓度越高对植株的影响越大。150、200 mM NaCl处理下的野生型生长受抑制、叶片发黄，而转基因株系受到的影响相对较小 (图4)。结果说明过量表达BvNHX1基因明显提高了转基因拟南芥的耐盐性。同时，别的转基因株系的表型与b30－3相似，所以本图中只提供了b30－3株系的表型图。

2.3.3 盐处理对转基因植株和野生型植株鲜重和干重的影响 盐胁迫对植物生长的影响主要体现在地上部分的干重和鲜重的降低。我们对盐胁迫后野生型和转基因株系的鲜干重测定后发现，与0 mM NaCl条件下相比，各种浓度盐处理下的植株鲜重和干重均下降，且随着处理盐浓度的升高降幅增大。与盐处理表型一致的是，转基因植株叶片的鲜重和干重在不同盐浓度下高于野生型对照，尤其200 mM NaCl处理下，两个转基因株系的鲜重和干重都显著高于野生型对照 (图5)。

2.4 盐胁迫对野生型和转基因植株中Na+、K+离子含量的影响

液泡膜Na+/H+转运蛋白将Na+运送到液泡中，为了验证BvNHX1的表达是否影响拟南芥中Na+和K+的积累，对野生型和转基因株系中Na+和K+含量进行检测。0 mM NaCl条件下，野生型和转基因株系中Na+和K+的含量基本没有差别，随着盐浓度的升高，野生型和转基因植株叶片中的Na+离子含量均持续增加而K+离子含量持续减少。但与野生型对照相比，转基因植株地上部分的Na+(图6 A)和K+(图6B)含量都相对较高，且150 mM NaCl处理下转基因株系的K+含量比野生型显著升高。结果表明，表达BvNHX1基因促进了盐胁迫下转基因植株对K+的吸收，这与其在高盐条件下较好的生长趋势是一致的。

3 结论与讨论

在盐胁迫环境中，植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白能将胞质中的Na+区隔化至液泡中，以避免过多的Na+干扰细胞内正常的生理生化代谢，从而有利于植物在盐渍化土壤中生存。过量表达NHX基因能明显提高植物的耐盐性［5］。

在甜土植物拟南芥和番茄中均有多种基因编码NHX，而其表达水平均较低。通过对比甜土植物拟南芥和盐生植物盐芥Thellungiella halophila的基因表达差异性，证明耐盐性不同的物种之间胁迫相关基因和离子转运体的表达水平存在差异［18，19］。甜菜［4］中的NHX基因显著被盐胁迫诱导，而在拟南芥中其盐诱导幅度不明显。这些结果显示盐生植物和甜土植物中Na+/H+逆向转运蛋白在基因表达模式上存在差异，暗示在耐盐的功能方面也存在很大差异。另外，Xia等人认为耐盐植物和盐敏感植物中Na+/H+逆向转运蛋白的活性是有差别的［4］。本研究从甜菜cDNA中克隆得到BvNHX1基因，通过转化拟南芥来探讨它在耐盐中的作用。耐盐性分析实验表明:转基因植株能更好的适应盐胁迫，保持良好的长势。不同盐浓度条件下，转基因株系的鲜重、干重均相对高于野生型植株。表达BvNHX1基因促进了盐胁迫下转基因植株对K+的吸收，进一步证明了过量表达BvNHX1能促进K+的吸收和有效利用［2］，这与其在高盐条件下较好的生长趋势是一致的。盐胁迫条件下，K+的积累对植物耐盐性非常重要，盐胁迫下保持高的K+/Na+比有利于植物对抗盐胁迫，我们的实验也发现过量表达BvNHX1基因提高了转基因拟南芥K+/Na+比 (数据未提供)，并提高了转基因拟南芥的耐盐性。过量表达BvNHX1基因提高拟南芥的耐盐性与叶片中K+升高可能具有很大的关系。转基因株系叶片中Na+和K+含量的升高可能是由于过量表达BvNHX1基因使液泡中的Na+和K+含量升高所导致，我们将进一步分析液泡中Na+和K+含量，进一步明确过量表达BvNHX1对拟南芥耐盐性的影响。

总之，我们的结果发现，过量表达BvNHX1基因提高了盐胁迫转基因拟南芥的萌发率、鲜、干重，促进了转基因拟南芥的生长，提高了叶片中的Na+、K+含量和K+/Na+比，提高了转基因拟南芥的耐盐性。

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