小麦谷氨酰胺合成酶基因克隆与其表达特性分析

王小纯，张同勋，李高飞，程振云，刘 宁，马新明

(1．河南农业大学生命科学学院，河南郑州450002;2．河南省粮食作物生理生态与遗传改良重点实验室，河南郑州450002)

氮素是影响植物生长发育的主要元素．无论是直接来源于硝酸盐、氨离子、微生物固定氮，还是植物代谢过程中释放的氨，都必须经过谷氨酰胺合成酶(GS，)催化才能同化为氨基酸．GS和谷氨酸合成酶(Glutamate synthase，GOGAT)构成的 GSGOGAT循环是高等植物氮素同化的主要途径［1，2］．大麦、玉米、水稻、拟南芥等植物的 GS 基因已被克隆，GS功能研究已经成为提高氮素利用效率的研究热点之一．高等植物中有2类GS:一类定位于胞液中，称为胞液型GS，即GS1，一般由3～5个核基因编码;GS1主要参与种子萌发时储存氮源的转运及叶片衰老时氮源的转移及再利用;另1类定位于质体中，称为质体型GS，即GS2，由一个核基因编码，主要参与光呼吸、硝酸还原产生的氨的同化过程［1～5］．转GS1基因玉米的穗粒数及千粒重增加，氮素利用率提高［6］．水稻转组成型启动子启动的GS1和GS2转基因植株鲜质量增长量显著高于对照，GS1基因的过表达植株中叶片GS活性、可溶性蛋白质含量、整株总氨基酸和总氮含量提高，但产量和子粒中总氨基酸含量下降［7］．STEPHANIE等［8］从二倍体小麦cDNA文库中克隆了小麦的2种GS同工酶基因，进行了基因表达特点研究;韩娜等［9］从小麦耐盐突变体中克隆了谷氨酰胺合成酶Ⅱ前体基因，分析了编码GS2蛋白质的特点．本研究首次从普通小麦栽培品种叶片中克隆了GS1和GS2的全长cDNA，并对GS1编码的蛋白质特点进行了分析，探索了GS1和GS2在小麦不同组织中转录与表达特点，为进一步研究其在小麦生长发育过程中的调控方式及在氮素利用中的作用奠定了基础．

1 材料与方法

1．1 材料

以河南省小麦栽培品种豫麦49号苗期叶片为材料进行GS基因的克隆以及转录特性分析．

1．2 方法

1．2．1 RNA的提取与cDNA合成 利用Trizol试剂盒提取总RNA，DNaseI处理后DEPC处理水定容，利用质量分数1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性．cDNA合成采用20 μL反应体系(RNA，2 μg;M-MLV，200 U;dNTP，125 pmol;oligodT，100 pmol;RNasin，25 U)，42 ℃温浴 1 h，取 2 μL用于PCR扩增．

1．2．2 GS1基因的克隆 根据Genbank中提交的拟南芥、玉米和水稻等的GS1基因的保守序列设计引物:GS1F1:5'-TTGTCATGTGCGATTGCTAC-3'与GS1R1:5'-GGCGATGTGCTCCTTGTG-3'，以总 RNA 的反转录产物cDNA为模板进行PCR试扩增．PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后与PMDl9-T Vector连接，转化大肠杆菌Top10中，经过蓝白斑筛选阳性克隆，PCR鉴定后，进一步测序鉴定．在此基础上设计GS1的RACE特异引物．GS1的3'RACE以 cDNA为模板(引物设计见表1)，利用GS1P1与P1进行outer PCR，再以outer PCR产物为模板，利用 GS1P2和 P2进行 inner PCR．使用TaKaRa 5'-Full RACE Kit对3 μg小麦叶片 Total RNA进行 CIAP，TAP处理，并与5'RACE adaptor连接后，反转录合成cDNA，同时设立M-MLV(-)对照．利用基因特异引物GSP51与5'RACE试剂盒提供的outer Primer组合进行扩增，GSP52和inner Primer组合进行扩增．扩增片段回收均采用天根DNA凝胶回收试剂盒，连接到PMD-19载体中，转化到大肠杆菌TOP10，挑选阳性菌落测序鉴定．据RACE结果设计GS1全长正向引物GS1QF:5'-CTGCAGAAAGCACCACCCCCACC-3'和反向引物GS1QR:5'-CAGCTGGTGTGGTACCACGGCAGC-3'，并在正反引物两端分别添加了Pst I和Sal I酶切位点．PCR所获得扩增片段回收均采用天根DNA凝胶回收试剂盒，连接到PMD-19载体中，转化到大肠杆菌TOP10，挑选阳性菌落测序鉴定．

表1 GS1的RACE使用的引物Table 1 The primers of GS1 used in RACE

1．2．3 GS2基因的克隆 根据Genbank中提交的拟南芥和玉米，水稻等的GS2基因的保守序列设计引物:GS2F1:5'-TTCGAGGAGGCAACAAC-3'与GS2R1:5'-TAGAGCAGCCACGGTTCG-3'，通过 RTPCR扩增得到GS2基因的保守序列，此后操作步骤与 GS1克隆相同．GS2的3'RACE采用引物GS2F1与P1(表2)及GS2P3与P2两对引物组合．5'RACE的特异性引物 GS2P51与 GS2P52，与5'RACE试剂盒提供的outer及inner Primer组合进行扩增．据RACE结果设计GS2全长正向引物GS2QF:5'-CTTCCCTCCCTCCTCTCCTC-3'和反向引物GS2QR:5'-TATCCTTTTAATAACGTAGTTCTCCG-3'．凝胶电泳回收目的片段，克隆测序．

表2 GS2的RACE使用的引物Table 2 The primers of GS2 used in RACE

1．2．4 半定量PCR 提取小麦叶片样品总RNA，反转录获得的cDNA作为半定量PCR分析的模板．用于半定量分析的GS同工酶特异引物序列如下，GS1的引物:5'-TCCTGTGGAAGCCCTGAAGC-3'(正向)和5'-CGACGATGATGCGACCTACCTAA-3'(反向);GS2的引物:5'-GAACGGAGGCTGACAGGGCTAC-3'(正向)和 5'-ACAAGAATGGACGACGGACGAAC-3'(反向)．对照 β-actinF的引物:5'-CAGCAACTGGGATGATATGG-3'和 β-actinR:5'-ATTTCGCTTTCAGCAGTGGT-3';PCR扩增程序为94℃预变性2 min，94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，28个循环之后，72℃延伸5 min．

1．2．5 叶片蛋白质提取及Western-blot 取小麦叶片0．5 g 加入1．5 mL 的100 mmol·L-1Tris-Cl缓冲液(pH 值 7．6，含1 mmol·L-1MgCl2，1 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1β-巯基乙醇)，充分研磨后13 000 g离心10 min，上清液即为蛋白质提取液，取上清液加等量pH值 6．8变性缓冲液混合(含100 mmol·L-1Tris-HCl，200 mmol ·L-1二硫苏糖醇，4%十二烷基磺酸钠，0．2%溴酚蓝 )，沸水浴5 min，利用12．5%SDS-PAGE分离蛋白质，电泳结束后转移到PFDV膜上，进行Western blot分析．一抗为烟草GS抗体(Hirel惠赠)，二抗为羊抗兔(连接有辣根过氧化物酶)，显色试剂盒为天根辣根过氧化物酶DAB显色试剂盒．

1．2．6 序列分析 利用 ORF Finder查找 GS的cDNA编码区，并翻译成相应的氨基酸序列;利用DNAMAN 及 ExPaSy(http://www．expasy．org)对蛋白质的一级结构分析，采用PredictProtein(http://www．predictprotein．org/)对其2级结构预测分析;使用软件ClustalX和MEGA4．1，用邻接法构建不同植物GS的系统进化树．

2 结果与分析

2．1 小麦GS基因全长cDNA的克隆及序列分析

利用GS1特异引物扩增到了约580 bp的DNA片段，3'RACE扩增到了约820 bp的DNA片段，5'RACE扩增到550 bp的片段(图1)．在克隆测序分析的基础上，设计引物GS1QF与GS1QR，扩增到了小麦GS1全长cDNA(图1，泳道4)，随后进行了克隆测序，暂定名为Ta-unknow-GS1(GenBank登录号:HQ840647)．小麦GS1的cDNA全长为1 494 bp，其中5'UTR 为74 bp，3'UTR 为 349 bp，ORF 为1 071 bp，编码含356个氨基酸的蛋白质，理论相对分子质量为39．2 kD，理论等电点为5．41．Blastx分析表明，该基因与小麦的GS1a(GeneBank登录号:AAZ30057)同源性较高，但3'端非编码区存在较大差异．Ta-unknow-GS1的3'端终止密码的下游有一个AATAAA加尾信号，1 457 bp含AT-rich序列，转录后可形成一个发卡结构阻止RNA聚合酶的移动，而且对GS1的mRNA稳定性起作用．

图1 小麦GS1基因cDNA扩增产物Fig．1 Amplification results of GS1 of wheat

GS2同源扩增得到了约700 bp的中间片段(图2-A)，3'RACE 产物约1 200 bp(图2-B)，5'RACE产物约750 bp(图2-C)，全长 cDNA约1 600 bp(图2-D)．随后的克隆测序表明，小麦GS2的cDNA全长1 631 bp．Blastx分析表明，该基因编码蛋白质与小麦的GS2c同源，暂定名为Taunknow-GS2(GenBank登录号:JF894116)．GS2的5'UTR 长104 bp，3'UTR 长243 bp、ORF长1 284 bp，编码含427个氨基酸的蛋白质，理论相对分子质量为46．7 kD，理论等电点为 5．75．

2．2 小麦GS编码的蛋白质特点

小麦GS1半衰期理论值为30 h，不稳定参数为33．71，属于稳定蛋白．用ScanProsite进一步分析发现，GS1包含20个磷酸化位点，包括12个Ser位点、3个Thr位点和5个Tyr位点．采用ProtScale进行疏水性/亲水性分析显示，GS1亲水性最高分值为 -2．656，疏水性最高分值为 2．089，且疏水性/亲水性氨基酸分布比较均匀;N端为疏水区域，C端为亲水区域．利用SOPMA程序对GS1蛋白质的二级结构预测显示，该蛋白质由26．84%的α-螺旋、18．36%的延伸链、5．37%的 β -折叠及49．44%的无规卷曲．小麦GS2半衰期理论值为30 h，不稳定参数为38．92，也属于稳定蛋白质．GS2也包含24个磷酸化位点，主要在两端．包括13个Ser位点、6个Thr位点、5个Tyr位点．GS2亲水性最高分值为 -2．200，疏水性最高分值为 1．689，且疏水性/亲水性氨基酸分布比较均匀，N端为疏水区域，C端为亲水区域．2级结构预测显示，与GS1相似，GS2也主要由 α-螺旋(29．27%)和无规卷曲(46．14%)组成．利用 TargetP1．1Server分析显示，GS2定位于叶绿体，前导肽长度为38个氨基酸．

图2 小麦GS2基因扩增产物Fig．2 Amplification results of GS2 of wheat

2．3 小麦GS系统进化分析

将Ta-unknow-GS1和Ta-unknow-GS2的编码的氨基酸序列与主要禾谷类作物以及模式植物GS的氨基酸序列进行了系统进化分析，如图3所示，形成了2个相对独立的分支，即GS2与GS1．GS2进化关系与植物分类一致，即C3植物小麦和水稻亲缘关系最近，禾本科植物中C3植物(小麦和水稻)与C4植物(玉米)亲缘关系较近，而单子叶植物(小麦、水稻和玉米)与双子叶植物拟南芥亲缘关系最远．GS1进化关系比较复杂，与植物学上的分类不一致．小麦不同的GS，即GS1，GS2，GSe和GSr处于不同的分支．TA-unknow-GS1与小麦TAGS1a具有最大的相似性，与禾谷类作物玉米的ZM-GS1-3，ZM-GS1-4及水稻的OS-Gln11亲缘关系最近;而与小麦的TA-GSr、玉米的ZM-GS1-1和ZM-GS1-5、水稻的 OS-Gln1-12及拟南芥的 ATGLN14进化距离较远．TA-unknow-GS2与小麦GS2c具有最大相似性，与禾谷类作物玉米的ZMGS2及拟南芥亲缘关系最近;而与小麦的TA-GSr、玉米的ZM-GS1、水稻的OS-Gln1及拟南芥的ATGLN1进化距离较远，属于不同的进化分支．

图3 不同植物GS基因进化树Fig．3 Unrooted phylogenetic tree of GS protein sequences from different plants

2．4 小麦苗期叶片GS同工酶转录特点

小麦第1片叶从出现到衰老整个生长周期GS1转录特点如图4-A所示．出苗后4～16 d，即叶片伸长到功能盛期及出苗后30 d，叶片变黄时，GS1转录水平都比较低;出苗后20～28 d叶片开始衰老时，GS1-mRNA转录水平最高．与GS1相比，叶片GS2转录表现出完全不同的特点．从出苗后4 d到出苗20 d，即叶片从伸长到功能盛期，GS2-mRNA转录水平逐渐升高达到最大;出苗后28 d叶片衰老时，GS2-mRNA转录水平迅速降低(图4-B)．

图4 小麦苗期叶片GS转录特性Fig．4 Transcription characteristic of GS of wheat leaves during seedling stage

2．5 小麦苗期叶片GS同工酶表达特特点

Western blot表明，小麦GS2亚基在出苗后4 d表达量最少;出苗后8～20 d GS2亚基表达量迅速增加，于出苗20 d达到最高;此后，GS2亚基含量逐渐降低．出苗后4～16 d GS1亚基表达量较少;在出苗20 d表达量最高，与其转录水平一致;随后呈下降的趋势，但衰老叶片时GS1的表达水平显著高于新生叶片．

图5 小麦苗期叶片GS表达特性Fig．5 Translation characteristic of GS of wheat leaves during seedling stage

3 结论与讨论

MARTIN等通过基因突变及基因过表达证明ZM-GS1-3和ZM-GS1-4对玉米植株生物量没有影响，却显著影响玉米的子粒性状．ZM-GS1-3和ZMGS1-4突变导致穗粒数减少、千粒重降低;而其过量表达使穗粒数增加30%，推测其与生长后期氮素向子粒转运有关［6］．TA-unknow GS1与ZM-GS1-3及ZM-GS1-4亲缘关系最近，在输导组织及开始衰老叶片中表达量也相对较高，可能参与氮素向子粒的转移，可能对小麦产量影响较大．OS-Gln1-1过量表达可提高其对土壤氮素缺乏的耐性，促进氮素利用［11］．TA-GS1和OS-Gln1-1在同一个进化分支上，小麦GS1是否也对提高小麦氮素利用率及氮胁迫具有重要作用有待于进一步研究．

GS同工酶活性的调控在RNA转录、蛋白质翻译及翻译后修饰等不同水平上实现［12～15］．非编码区的调控元件对基因表达具有重要的调控作用，STANULOVIC等认为，GS下游基因可以与上游增强子及基因3'端互作，阻止与上游的增强子及基因5'端调控元件的作用［15］．去除大豆GS1基因的3'非编码序列，可增强GS1 mRNA及其蛋白质的积累，而且3'非编码序列对硝酸钾还有应答反应［16］．通过分析发现，克隆的小麦GS1基因的5'及3'非编码序列具有特异性，能否通过非编码区突变提高GS1表达量，从而提高GS活性，促进氮素同化和转运、提高氮素利用效率尚需进一步研究．小麦叶片GS1-mRNA在开始衰老时量最大，其他时期转录水平较低也相近;GS2-mRNA在叶片快速伸长期和定长期叶大量转录，在叶片衰亡期转录几乎终止．Western-blot显示在苗期光合旺盛的叶片中GS1和GS2表达量均较高．因此，GS1可能与氮素的转移再利用有关，包括功能期同化氮的输出及衰老时氮的大量转运;GS2与氮素的同化密切相关．

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