玉米秸秆高效分解菌株的筛选、鉴定及产酶条件优化

东北农业大学 杨 琼 孙满吉＊ 黄立敏 王 寅 朱继红 徐春桃 李建平

秸秆的粗纤维含量高，粗蛋白质很低，导致其质地粗硬，适口性差，不易消化，家畜采食量低，饲用价值不高 （李延云，2006；冯仰廉和张子仪，2001；Kayongo，1993）。 利用微生物产生的纤维素酶降解纤维素，具有条件温和、产物产率高和无二次污染等特点 （徐广等，2007； 张红莲，2004），因此，发展和利用产高活性纤维素酶的微生物对纤维素原料进行分解转化是一种有效的资源利用途径（肖舸等，2004；Tomme，1995）。反刍动物瘤胃内存在大量的细菌、纤毛虫和真菌，能够利用饲料中的纤维素、半纤维素，进行分解和发酵，转化为宿主的营养物质和能量（刘敏雄，1991）。因此，本试验以玉米秸秆为主要原料，采用体外培养固态发酵方法，旨在从奶牛瘤胃液中分离筛选出一株纤维素酶高产菌株，并对其产酶条件进行优化，最终为高效利用秸秆资源提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基 富集培养基 （100 mL）：CMC-Na 1.0 g，K2HPO40.1 g，MgSO4·7H2O 1.01 g，MnSO45×10-5g；蛋白胨 1.0 g，酵母膏 1.0 g，pH 6.4 ～ 6.8。

分离筛选培养基：羧甲基纤维素钠5 g，K2HP041 g，NaN033 g，MgSO40.5 g，琼脂 17 g，蒸馏水l000 mL，pH 6.4～6.8；斜面活化保藏培养基：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂 17 g，蒸馏水 1000 mL，pH6.4～ 6.8。

玉米秸秆培养基：玉米秸秆粉3 g，蒸馏水100 mL（固体培养则不加水），pH自然。

1.1.2 溶液 配制3，5-二硝基水杨酸（DNS）显色剂，0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH=6.0），1 mg/mL 的葡萄糖标准溶液，0.5%羧甲基纤维素钠底物溶液，0.5%微晶纤维素底物溶液，0.5%水杨苷底物溶液。

1.2 方法

1.2.1 鲜瘤胃液的采集以玉米秸秆为粗料预饲东北农业大学实验基地的4头已装置永久瘤胃瘘管的奶牛，预饲期为 2周。 晨饲（06∶00）后 2 h，于 4头瘘管牛瘤胃内上下左右不同位点采集足量瘤胃液，混合并用两层纱布过滤，灌入经预热达39℃并通有CO2的保温瓶中，立即盖严瓶口，迅速返回试验室。

1.2.2 富集培养取1 mL鲜瘤胃液接种至已灭菌的富集培养基中厌氧培养20 h。

1.2.3 菌株的初筛取富集后的培养液做梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，分别涂布筛选平板，倒置恒温厌氧培养24 h，分离出能够旺盛生长，并有明显透明水解圈的菌株。

1.2.4 菌株的复筛挑取透明圈最大的11株菌，先在分离筛选培养基上进行连续划线纯化培养。再将纯化后的菌株进行斜面活化保藏及富集培养20 h并计数。取富集培养后的11株菌的菌液10 mL，分别接入玉米秸秆培养基中，准确记录玉米秸秆粉的重量，每株菌3个重复，厌氧恒温培养60 h，另做一个空白对照组。60 h时将玉米秸秆培养物用定量滤纸过滤，60℃烘干回潮后称重，通过测定处理后的玉米秸秆粉的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维选出对玉米秸秆纤维分解率最高的一株瘤胃菌。

1.2.5 菌株的保藏将选出的菌株在平板上连续划线纯化培养40 h，然后接入含斜面活化保藏培养基的试管中，培养40 h后放入4℃冰箱中保藏。

1.2.6 菌株的鉴定 用接种环挑取少许新鲜的菌丝涂布于干净玻片上的一滴无菌水或是蒸馏水中，风干固定，染色。用光学显微镜观察菌株的形态特征。

1.2.7 不同条件下的酶活测定

1.2.7.1 接种量对酶活影响 接重量按2%，4%、6%、8%、10%、12%、14%接种至玉米秸秆固体培养基上，培养基含水6 mL，培养60 h后测酶活。

1.2.7.2 培养时间对酶活影响 培养条件与1.2.7.1中相同，接种量为1.2.7.1中所得最优接种量，分别在 24、36、48、60、72 h 时测酶活，每个重复3次。

1.2.7.3 不同氮源对酶活力影响 培养条件与1.2.7.2 中相同，以（NH4）2SO4、NH4NO3、蛋白胨、酵母膏作为氮源。固体培养基分别添加上述氮源（总氮量为0.4%），培养后测酶活，每个重复3次。

1.2.7.4 吐温80含量对酶活的影响 培养条件与1.2.7.3 相同，在含吐温分别为0.5%、1%、1.5%、2%的培养基上培养后测酶活，每个重复3次。

1.2.8 酶活力测定

1.2.8.1 葡萄糖标准曲线绘制 分别吸取葡萄糖标准溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 至 6 支刻度试管中，蒸馏水定容至2 mL，另取一支试管加2 mL蒸馏水做空白调零，往各试管中加2mol/LNaOH 溶液 0.5 mL，DNS 试剂 1 mL，沸水浴5 min后立即冷却，定容至10 mL，测其540 nm紫外光吸收值。以紫外光吸收值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标绘制葡萄糖标准曲线。

1.2.8.2 粗酶液的制备 将固体酶曲中加入30 mL蒸馏水充分搅拌，50℃水浴锅中水浴10 min后过滤，滤液即为粗酶液。

1.2.8.3 测定方法 纤维素酶活力测定：将0.5%微晶纤维底物悬浮液及粗酶液水浴预热至50℃，取 4 支 10 mL 刻度试管，编号为 1、2、3、4，何 4 支试管里加1.5mL底物溶液，并向1号试管里加1mL DNS溶液以钝化其中的纤维素酶，作为空白调零，另3支试管加0.5 mL粗酶液，50℃水浴振荡10 min，立即取出加入0.5 mL 2mol/LNaoH溶液，并向2，3，4号试管内加入1 mL DNS溶液，沸水浴5 min后迅速冷却，用蒸馏水定容至10 mL，540 nm下测定吸光度。

内切葡聚糖酶活力测定：将0.5%羧甲基纤维素钠及粗酶液预热至50℃，方法同上。

纤维二糖苷酶活力测定：将0.5%水杨苷底物溶液及粗酶液预热至50℃，方法同上。

木聚糖酶活力测定：将0.5%木聚糖底物溶液及粗酶液预热至50℃，方法同上。 酶活定义为在上述条件下，1 mg酶每分钟催化底物水解成葡萄糖微克数定为一个活力单位。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选 通过刚果红筛选培养基从瘤胃液中筛选出11株透明圈较大的纤维分解菌。并将11株菌进行了纯化。复筛时以处理后的玉米秸秆粉的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维为指标，选出对玉米秸秆纤维分解率最高的一株瘤胃菌，该菌的编号为Q3。该菌株20 h富集培养液的菌数为2.3×1015∕mL。玉米秸秆经该菌处理后NDF含量从84.72%降至77.35%，Q3菌株使玉米秸秆中的NDF含量降7.37个百分点，ADF的含量从51.85%降低至44.78%，降低7.07个百分点。

2.2 菌株的初步鉴定 本次试验所筛出的Q3菌柱在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上的菌落边缘整齐，呈圆形，为乳白色，不透明，湿润，微隆起。显微镜下观察菌体形态为短杆状，革兰氏染色结果显示为革兰氏阳性菌。V.P反应为阴性，甲基红反应、吲哚反应为阳性。菌株能水解淀粉和利用葡糖糖产酸，不能利用柠檬酸盐。结合以上特征，参考《伯杰细菌鉴定手册》第八版，该菌株初步鉴定为芽孢杆菌属。

2.3 不同条件下酶活测定 图1为DNS法葡萄糖标准曲线，葡萄糖标准曲线的线性回归方程为y=1.5308x+0.0198。

2.4 接种量对酶活的影响 由图2可知，当接种量为8%时，所测酶活的整体水平较高，此时纤维二糖苷酶酶活为3719 U/g，内切葡聚糖酶酶活为3380 U/g，纤维素酶酶活为4098 U/g。原因可能是接种量低于8%时，营养过剩，菌丝体徒长，产酶滞后；接种量高于8%时，则菌丝体增长迅速，后期营养不良，且温度升高，不利于产酶。

2.5 培养时间对酶活的影响 由图3可知，培养60 h时，各项酶活指标整体水平较高，具体数值与2.4一致。原因可能是，前60 h菌体正迅速增殖，随着纤维菌的增殖产酶量增大，但菌体增殖的同时有害代谢物的排除也增加，60 h后有害代谢物的增加使菌体进入衰亡期，从而不利于产酶。

2.6 不同氮源对酶活的影响结果 由图4可知，NH3NO3为氮源时，酶活的总体水平较高，此时纤维二糖苷酶活为5265 U/g，内切葡聚糖酶活为5684 U/g，纤维素酶活为5862 U/g。由此可确定本试验中，该菌的最优氮源为NH3NO3。

2.7 吐温80含量对酶活的影响 由图5可知，当吐温80的含量为1%时，所测酶活整体水平较高，此时纤维二糖苷酶活为6512 U/g，内切葡聚糖酶活为595 1U/g，纤维素酶活为8578 U/g。表明一定含量的吐温80能提高细胞质膜的通透性，从而有利于酶排除细胞体外，但吐温含量过高可能会影响菌体的正常代谢，从而产酶功能受到影响，导致酶活降低。

3 结论

3.1 经过初筛和复筛，选出对玉米秸秆纤维分解能力最强的一株瘤胃菌，编号为Q3，根据菌株形态、生理生化特征将菌株初步鉴定为芽孢杆菌属。

3.2 试验表明，此菌株最适宜产酶条件为：接种量8%、氮源NH3NO3、吐温含量1%，培养时间60h。

3.3 该菌所产胞外纤维素酶，分离过程不需要破碎细胞，便于酶的分离提纯，可大大减少工序，降低成本。

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