黄瓜香总黄酮对H2O2诱导的肝损伤的保护作用

陈娅萍 史廷娇 高淞文 唐丁卯 邓 葵 李春艳

1．湖南省吉首大学医学院07级临床医学，湖南 吉首 416000;2．湖南省吉首大学医学院机能实验教研室，湖南 吉首 416000

黄瓜香学名蔓茎堇菜、葡付堇，属堇菜科，堇菜属(Viola diffusa Ging)，多年生草本植物，是盛产于湖南湘西等地区的一种中草药。其主要化学成分为黄酮类，具有清除自由基，抑制过氧化损伤作用［1－2］。本实验室以黄瓜香为研究对象，对它的活性成分——总黄酮进行提取分离，并用传代培养的肝HapG2细胞，通过H2O2建立氧化应激损伤的细胞模型，研究总黄酮对肝HapG2细胞氧化应激损伤的保护作用，为实现黄瓜香提取物在临床上的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 仪器 二氧化碳培养箱、倒置显微镜、超净工作台、TGL216G高速台式离心机、UV－3系列紫外可见分光光度计、酶联免疫检测仪、全自动生化分析仪 (均为上海美谱达仪器有限公司)。25cm2细胞培养瓶、96孔培养板、6孔培养板 (均购于碧云天公司)。

1.1.2 试剂和药品 黄瓜香醇提物，传统方法醇提、浓缩，临用时用双蒸水稀释成所需浓度 (实验所用剂量均以生药计)，并用0.22um滤过膜滤过。DMEM培养基、胎牛血清、PBS液(均由碧云天公司提供)，双氧水 (成都化工原料有限公司)，二醛 (MDA)试剂盒、基噻唑蓝 (MTT)、ALT测试剂盒(均购于碧云天公司)，无水乙醇、乙醚等其它化学试剂均为分析纯，双蒸水 (吉首大学创新实验室提供)。

1.1.3 细胞 肝细胞为HapG2细胞，购于武汉博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 黄瓜香总黄酮的分离纯化

本实验所用黄瓜香采自湖南湘西，夏末采集，全植物干燥后粉碎，加入60%的乙醇，80℃条件下提取，提取液经过滤、乙醚萃取、再过滤，得黄瓜香提取物 (总黄酮)。

1.2.2 肝细胞培养及损伤模型的建立

将原代HapG2细胞，加入胰蛋白酶溶液8ml，37℃消化，盖好瓶盖在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，倒掉胰酶，加入含10%牛胎血清的新鲜培养基10ml，稀释成含5×106/L个细胞细胞悬液，将细胞悬液接种于96孔培养板中和6孔板 ，96孔培养板100μl/孔，6孔板2ml/孔，置 CO2培养箱 (5%CO2，95%空气，37℃)中培养2h。待细胞长至对数期后分组实验:对照组:只加入含牛胎血清的培养基孵育1h;H2O2损伤模型组 (H2O2):加入0.6mmol/L H2O210ul，孵育1h，建立氧化应激损伤模型;黄瓜香－1.0、3.0、10.0、30.0干预组:每组分别加入终质量浓度为 1.0mg/L、3.0mg/L、10.0mg/L、30.0mg/L的黄瓜香及0.6mmol/L的H2O2孵育1h;每组设3个重复。

1.2.3 MTT法检测 将三个分组分别加入 DMSO 100 ul/孔，按试剂盒说明步骤，待甲臜完全溶解后，用酶联免疫检测仪在波长570nm处读取吸光度 (A 570)。

1.2.4 ALT的检测 将分组实验后肝细胞经离心 (1800r/min，10min)后收集上清，按试剂盒说明书步骤操作，用全自动生化分析仪速率法检测，结果以U/孔表示。

1.2.5 MDA含量的测定 用胰蛋白酶消化分组培养至贴壁的HapG2细胞细胞，收集2×106细胞，用PBS洗2次。待细胞分散后，将各组细胞的培养液倒掉，将细胞裂解后，根据试剂盒说明步骤操作，测定MDA含量，可见光分光光度计532 nm测上清液的吸光值，吸光值表示丙二醛含量的多少，吸光值越大，丙二醛含量越高，结果以mmol/孔计。

1.3 统计学方法 经SPSS 13.0统计软件进行统计分析，数据用±s表示，计量指标用方差分析。以α=0.05为检验水准。P＜0.05认为差异有统计学意义，相差显著;P＜0.01时为相差非常显著。

2 结果与分析

2.1 黄瓜香总黄酮对H2O2诱导的HapG2细胞增殖的影响

MTT实验是检测细胞活力的实验方法，活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲臜颗粒积于细胞内和细胞周围，其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比［3］。因此MTT常常用来检测细胞的增殖情况。采用荧光免疫法测定细胞活性 (MTT)，以实验分组为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制柱状图，见图1。

由图1可知，与模型组比较:对照组HapG2细胞增殖活跃 (P＜0.01);黄瓜香各剂量组HapG2细胞增殖随黄瓜香浓度的增加而逐渐增加 (黄瓜香浓度为3.0mg/L时P＜0.05，黄瓜香浓度为10.0mg/L时P＜0.01)，说明黄瓜香总黄酮能促进H2O2诱导的肝HapG2细胞的增值。

2.2 黄瓜香总黄酮对H2O2诱导的HapG2细胞受损的影响

ALT是一种非血浆特异酶，是肝功能检验的重要指标，是反映肝细胞受损最敏感的指标［4］。采用全自动生化分析仪速率法检测细胞培养液ALT的水平，观测黄瓜香总黄酮对H2O2诱导的HapG2细胞受损的影响程度，结果见图2。由图2可知，与模型组比较:对照组HapG2细胞无明显受损 (P＜0.01);黄瓜香各剂量干预组HapG2细胞受损明显降低 (黄瓜香浓度为3.0mg/L时P＜0.05，黄瓜香浓度为10.0mg/L时P＜0.01)，说明黄瓜香总黄酮能降低H2O2诱导的HapG2细胞受损，具有保护肝HapG2细胞的作用。

2.3 黄瓜香总黄酮对H2O2诱导的HapG2细胞脂质过氧化的影响

MDA是介导自由基损伤的重要物质，可与蛋白质、核酸、碱基、生物胺、磷脂等含有氨基的物质作用而发生交联，导致生物大分子及生物膜结构的损伤［5］。其作为生物膜磷脂中多不饱和脂肪酸受自由基攻击而产生的终产物之一，可以反映出体内脂质过氧化损伤的水平。分光光度法检测细胞丙二醛 (MDA)水平，检测黄瓜香总黄酮对H2O2诱导的HapG2细胞受损的影响，结果见图3。

由图3可知，与模型组比较:对照组肝HapG2细胞无明显脂质过氧化损伤 (P＜0.01);黄瓜香各剂量组HapG2细胞脂质过氧化损伤程度随黄瓜香浓度的增加逐渐降低(黄瓜香浓度为 3.0mg/L时 P＜0.05，黄瓜香浓度为10.0mg/L时P＜0.01)，说明黄瓜香总黄酮能抑制脂质过氧化反应，降低H2O2诱导的HapG2细胞的损伤。

3 结论与讨论

黄瓜香化学成分主要为黄酮、糖类、粘液质［6］。植株总黄酮含量为2.39%，根总黄酮含量为1.08%，细胞悬浮物总黄酮含量为0.76%［7］。本实验采用 H2O2诱导肝HapG2细胞损伤，建立体外氧化应激损伤模型。实验选用了0.6mmol/L H2O2诱导损伤1h，使肝细胞处于尚能保护的自由基环境，保证了实验的可行性，与某些文献报道的浓度基本吻合［8］。

本实验显示:黄瓜香总黄酮具有很强的体外抗氧化能力，可以促进H2O2诱导的肝HapG2细胞的增殖，抑制脂质过氧化反应，对氧化应激状态中的肝HapG2细胞具有保护作用。黄瓜香浓度为3.0mg/L时有统计学差异，浓度为10.0mg/L有显著统计学差异。提示黄瓜香能有效减低氧化应激损伤，发挥对肝细胞的保护作用。其机制可能与生物类黄酮药理作用一致:黄瓜香水提物中所含有的黄酮，能提供大量的酮羟基还原自由基，从而起到抗自由基作用。且体外试验还表明:黄瓜香提取物对·OH均具有良好清除作用，且浓度愈大清除率愈高［9］，表明黄瓜香提取物是良好的羟自由基清除剂，能减轻H2O2引起的肝细胞脂质过氧化，并对肝细胞有保护作用。弄清楚黄瓜香抗肝损伤的机制，并对其进行开发，不仅具有重要的社会效益而且具有重要经济效益。

［1］孙福祥，杨明霞，娜仁花，等.枣总黄酮对阿霉素所致红细胞过氧化的抑制作用［J］．中成药，2001，23(8):606．

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［7］中国科学院中国植物志编辑委员会．中国植物志．［M］．北京:科学出版社，1991，51:35－36．

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［9］杨俊林，沈恂．生物系统中活泼中间体与脂质过氧化［J］．学通报，1997:(6):5．