高效液相色谱法测定缓释微球中酮康唑的含量

张艳红，孙丽建，李 强，赵冬梅，王清文

（1.东北林业大学 生物质材料科学与技术教育部重点实验室，哈尔滨 150040；2.黑龙江大学 化学化工与材料学院，哈尔滨 150080；3.黑龙江东方学院 食品与环境工程学部，哈尔滨 150086）

酮康唑（Ketoconazole）是一种咪唑类广谱抗真菌药，通过抑制霉菌细胞膜中麦角甾醇的生物合成达到抗真菌的作用[1]。随着近年来真菌病的发病率迅猛增长，越来越多的科研机构致力于酮康唑的研究及开发[2]。目前，国内外文献中测定酮康唑所采用的HPLC法多用于粉剂、片剂、霜剂以及生物体液中酮康唑的检测，但对于载药微球缓慢释放溶出液中酮康唑的含量测定，尚未见报道。本文建立了一种适用于测定微球中酮康唑含量的高效液相色谱（HPLC）测定法。

1 仪器与试剂

岛津LC-10AT高效液相色谱仪，配有SPD-10A型检测器。甲醇（色谱纯），三乙胺（分析纯），磷酸（优级纯），水（双蒸馏水），酮康唑对照品（湖北恒硕化工有限公司），酮康唑缓释微球（实验室自制）。

2 方法与结果

2.1 酮康唑缓释微球的制备

将乳酸－羟基乙酸共聚物（PLGA）溶于混合溶剂（苯／1，2-二氯乙烷＝17／10）中，再加入酮康唑，使其溶解成作为分散相的均一透明溶液，采用微流控装置，将分散相滴入8%聚乙烯醇水溶液中制备载药微球。将分离干燥后的微球装入密封袋中保存。图1是放大40倍的显微镜下观察到的不同分散相流速下的PLGA载药微球的照片，通过调整微流控装置中分散相的流速即可得到不同粒径的微球。图2是在放大40倍的显微镜下观察到的微球照片，所得微球表面光滑，粒径较均一。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取一定量微球样品置于烧杯中，加入一定量的苯使微球溶解，将溶解后的溶液置于分液漏斗中，加入一定量的甲醇溶液萃取，连续萃取3次，合并萃取液并定容，即得供试品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱为 ODS C18（250mm×4.6mm，5μm，迪马公司），流动相为甲醇：磷酸缓冲盐＝80／20（磷酸缓冲盐：0.34mL磷酸与200mL双蒸馏水混合，用三乙胺调节pH＝3.0），检测波长为242nm，流量为0.80mL／min，柱温为室温，进样量为20μL。

2.4 标准曲线的绘制

精密称取一定量80℃减压干燥至恒重的酮康唑对照品，用流动相配制成浓度分别为1.0、2.5、5.0、10、15、20、30μg／mL的对照品溶液，各进样20μL，按上述色谱条件测定峰面积。以酮康唑浓度（C）对峰面积（A）进行线性回归，得回归方程为Y＝27298 X＋159.39（r＝0.9999）。该结果表明酮康唑在1.0～30.0μg／mL线性关系良好。

最低检出限确定：取不同浓度的对照品溶液进行色谱分析，当主峰峰高为噪音峰高3倍时的浓度即为仪器的最低检出限，酮康唑的最低检出限为10.8ng／mL。

2.5 专属性试验[1]

在2.3色谱条件下，分别对供试样溶液、对照品溶液和阴性对照品溶液（不含酮康唑的微球处理液）进行色谱分析，色谱图见图3。可见供试品与对照品溶液的色谱图分别在保留时间（tR）5.89 min和5.63min处出现单一酮康唑吸收峰，阴性对照品溶液色谱图在tR＝5.89min附近没出现任何吸收峰，表明专属性好。理论塔板数按酮康唑峰计算应≥2000。

图3 色谱图Fig.3 Chromatograms

2.6 精密度试验（重复性）

取6份同一批次制备的缓释微球，按2.2方法将药物萃取并定容，制成浓度约为2.50μg／mL的对照品溶液，进行色谱分析，计算实际测得的浓度，结果见表1。

表1 精密度试验（重复性）结果Table1 Precision experiment（repeatability）

2.7 回收率试验

取3份空白微球置于烧杯中，分别精密加入一定量的酮康唑，按2.2方法进行萃取、定容、进行色谱分析，计算回收率，结果见表2。

表2 回收率试验（n＝3）Table2 Recovery rate test（n＝3）

2.8 微球样品中酮康唑含量的测定

按2.2方法制备供试品溶液，按2.3中的色谱条件进样20μL，记录色谱图，按照工作曲线法计算样品中酮康唑含量。载药量为20%的PLGA微球中酮康唑的释放曲线见图4。

图4 载药量为20%的PLGA微球的释药曲线Fig.4 Release profile of 20%drug-loaded PLGA microspheres

3 结 论

药典中HPLC法测定酮康唑制剂含量的流动相为0.2%的二异丙胺的甲醇溶液和0.5%的醋酸铵溶液（77／23）[3]。但在实际测定时，出峰时间较长约7 min，且峰形不好。其他文献中流动相多为70%～90% 甲醇[4－6]。本文采用甲醇／缓冲盐（80／20）时，由于加入三乙胺扫尾剂，可以改善色谱峰形，得到的是较为尖锐、对称的峰形。该方法保留时间仅为5.89min，因此该方法优于药典中的方法。

实验表明，HPLC法分离效率高、速度快，流动相可选择范围宽、灵敏度高、色谱柱可反复使用，适用于酮康唑微球中酮康唑含量的测定。

[1]徐兰琴，黄 雁.高效液相色谱法直接测定酮康唑含量[J].广州医学院学报，1997，25（4）：84-86.

[2]杜继红，王娅芳，周艳飞，等.高效液相色谱法测定复方酮康唑溶液中酮康唑的含量 [J].中国动物保健，2009，（1）：103-104.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[M].北京：化学工业出版社，2010：1066.

[4]叶杰胜，孙 莉.HPLC法测定复方酮康唑软膏中酮康唑含量的不确定度评定 [J].安徽医药.2011，15（10）：1216-1218.

[5]田随安，张向兵，李永利.消毒洗剂中酮康唑的高效液相色谱测定法 [J].环境与健康杂志，2007，24（10）：809-810.

[6]倪 华，范义凤.高效液相色谱法测定复方酮康唑凝胶中酮康唑的含量 [J].交通医学，2008，22（3）：317-318.