山梨酸钾的毒理学评价

曾 婷，谢逸欣，马 丽

（广州军区疾病预防控制中心，广东 广州 510507）

山梨酸盐是一种抗菌防腐剂，具有抗细菌和抗真菌的性质，通常用于口服和局部用制剂中，特别是含有非表面活性剂的制剂中，常用浓度是0.1%～0.2%。一般认为它是相对无毒的食品添加剂，但是，也有一些关于山梨酸盐不良反应的报道，包括皮肤刺激性、过敏性或超敏性反应，然而口服山梨酸盐未见系统不良发应的报道[1]。为了探明其食用的安全性，现对其常用品种山梨酸钾进行安全毒理学评价。

1 材料与方法

1.1 样品 山梨酸钾(河南浩鑫生物科技有限公司，纯度>98%)，白色结晶性粉末，无异味，易吸湿。

1.2 实验动物 健康昆明种小鼠，雌雄各半，体重18～22 g；于2008年购入即用于本实验，由四川省医学实验动物中心提供(川动管字第2008 09号)。实验环境：温度23℃～25℃，相对湿度65%～70%。

1.3 实验方法 根据卫生部2003年发布的《食品安全性毒理学评价程序》(GB15193)中要求的方法进行相关实验[2]。实验中以实际给药量为依据，配制相应浓度的山梨酸钾水溶液，即配即用。

1.3.1 急性毒性实验 将昆明小鼠40只随机分为对照组及受试组各20只，雌雄各半，分养在4个笼里。采用寇氏法测定LD50。实验过程：实验小鼠隔夜空腹，24 h内口服给药(灌胃)，给药量为0.4 ml/20 g。三周内连续观察，记录动物进食、一般活动(中毒表现)、大小二便以及死亡情况[3]，并计算LD50。

1.3.2 骨髓细胞微核试验 小鼠50只，随机分为5组，雌雄各半。根据本品LD50=1 300 mg/kg设3个剂量组，分别为高剂量组(1/2 LD50=650 mg/kg)、中剂量组(1/4 LD50=325 mg/kg)、低剂量组(1/8 LD50=162.5 mg/kg)；并且设立溶剂对照组和阳性对照组共五个组别。阳性对照组在间隔24 h内，用环磷酰胺40 mg/kg连续灌胃两次，在最后一次给药后的6 h，劲椎脱位处死小鼠，将股骨骨髓腔制成的细胞悬液涂片置于Giemsa应用液中染色，在油镜下观察。用双盲法阅片，每只动物计数1 000个嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染红细胞数，微核率以千分率表示[4]。

1.3.3 小鼠精子畸形试验 将雄性小鼠50只随机分为五组，根据本品LD50=1 300 mg/kg设3个剂量组：高剂量组(1/2 LD50=650 mg/kg)、中剂量组(1/4 LD50=325 mg/kg)、低剂量组(1/8 LD50=162.5 mg/kg)；另设溶剂对照组和阳性对照组。阳性对照组以甲基磺酸甲酯(MMS)50 mg/kg体重灌胃。各组小鼠连续给药5 d，于第一次给药后的第35天处死，取出两侧附睾，常规制片，用伊红染色1 h，在高倍镜下检查精子形态，计数结构完整精子。每只动物观察1 000个精子形态(无钩、香蕉形、胖头、无定性、尾折叠、双头、双尾等)并计数[5]。

1.3.4 致畸试验 选用健康、性成熟且未交配的雌性小鼠40只以及雄性小鼠20只，随机分为四组，雌雄各半，根据本品LD50=1 300 mg/kg设3个剂量组，分别为高剂量组(1/2 LD50=650 mg/kg)、中剂量组(1/4 LD50=325 mg/kg)、低剂量组(1/8 LD50=162.5 mg/kg)和溶剂对照组。实验小鼠按照雌雄动物1:1比例同笼后，每日早晨检查阴栓(或阴道涂片)，查出阴栓(或精子)则认为该鼠已经交配，当日作为受孕0 d。如果5 d内未交配，则更换雄鼠。检出的妊鼠随机分组，并称重和编号，在受孕的第7～16天，每天给予本品。分别于受孕的0 d、7 d、12 d、16 d、10 d称重。每组实验孕鼠于妊娠第20天劲椎脱位处死5只，剖腹取出子宫称重，记录并检查吸收胎、早死胎、晚死胎及活胎数。活胎鼠出生24 h内逐一记录性别、体重、体长，对胎鼠进行体表检查(头部、躯干部、四肢)，观察是否有异常。定时称量体重，断乳时处死解剖，检查骨骼以及内脏(头部、胸部、腹部)有无畸形[6]。

1.3.5 30 d喂养试验 小鼠80只随机分成四组，每组20只，雌雄各半，根据本品LD50=1 300 mg/kg设3个剂量组，分别为高剂量组(1/4 LD50=325 mg/kg)、中剂量组(1/8 LD50=162.5 mg/kg)、低剂量组(1/12 LD50=108.3 mg/kg)和溶剂对照组。连续30 d，各剂量组按照相应剂量口服给药(灌胃)，溶剂对照组给予蒸馏水。每周观察并记录小鼠的一般表现、行为、中毒表现和死亡情况。每周称1次体重和食物摄入量。实验至30 d时，眼眶取血后颈椎脱位处死。测定红细胞(RBC)、白细胞(WBC)等血液学指标以及丙氨酸氨基转移酶(ALT)、尿素氮(BUN)、血糖(GLU)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)等血液生化学指标；对肝、肾、脾、胃肠等重要脏器进行组织病理学检查[7]。

1.4 统计学方法 本实验中所有数据均采用SPSS11.5进行统计；计数资料数据呈正态分布的比较采用t检验，非正态分布的比较采用卡方检验。计量资料采用配对t检验，以均数±标准差(±s)表示。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 急性毒性试验 试验期间，中、高剂量组部分小鼠出现了中毒症状，主要表现：反应迟钝，行为呆滞，缺乏知觉，呼吸减弱，流涎流泪等，同时有2只小鼠死亡。经查表得LD50=1 300 mg/kg，因此，本品属于低毒级。

2.2 骨髓细胞微核试验 根据试验结果统计分析，各实验组微核率均为1.8‰，差异无统计学意义(P>0.05)；和阳性对照组22.0‰比较，差异有统计学意义(P<0.01)，结果见表1。

表1 骨髓细胞微核试验结果

2.3 小鼠精子畸形试验 统计结果显示，各剂量组小鼠精子畸形率分别为2.84%、2.88%、2.94%，与溶剂对照组2.58%比较，差异无统计学意义(P>0.05)；和阳性对照组98.36%比较，差异具有统计学意义(P<0.01)，结果见表2。

表2 小鼠精子畸形试验结果(只)

2.4 传统致畸试验 小鼠妊娠前后的一般情况良好，且药物对其生殖能力并无明显影响。孕鼠妊娠14 d处死后，各剂量组与溶剂对照组比较，在吸收胎、早死胎、晚死胎及活胎数方面差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。各剂量组胎鼠体重、体长增长速度均无异常，各剂量组与溶剂对照组比较差异也无统计学意义(P>0.05)，见表4。肉眼检查胎鼠体表、头部、躯干部及四肢未见明显异常和畸形。处死后，检查枕骨、脊椎骨、骨盆等骨骼，未见明显异常和畸形。检查头部、胸部、腹部的内脏，在大小、形态等方面未见明显异常和畸形。

表3 山梨酸钾对胎仔影响试验结果比较(只)

表4 山梨酸钾对胎鼠出生后体重增长情况比较(±s)

表4 山梨酸钾对胎鼠出生后体重增长情况比较(±s)

组别 动物数(只)出生时间(d)07低剂量组中剂量组高剂量组溶剂对照组剂量(mg/kg)162.5 325 650 0 5555 1.70±0.20 1.69±0.21 1.65±0.19 1.71±0.22 3.56±0.35 3.51±0.41 3.49±0.32 3.61±0.40 14 5.59±0.40 5.52±0.44 5.33±0.47 5.66±0.42 21 12.01±0.61 11.95±0.57 11.92±0.60 12.02±0.53

2.5 30 d喂养试验

2.5.1 动物一般情况 实验过程中无动物死亡，各组动物毛发正常，无异常行为表现。在体重和食物摄入量方面，各剂量组动物与溶剂对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.5.2 血液常规检查 本实验中，各剂量组与溶剂对照组动物的RBC、WBC等血液学指标均在正常范围内，比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5.3 各实验组动物血清生化指标 根据实验结果，高剂量组与溶剂对照组动物的指标TC、TG比较差异具有统计学意义(P<0.01)，见表5。

表5 血液生化指标结果(±s)

表5 血液生化指标结果(±s)

注：实验组与溶剂对照组比较，*P<0.01。

组别低剂量组中剂量组高剂量组溶剂对照组剂量(mg/kg)108.3 162.5 325 0动物数(只)20 20 20 20 ALT(U/L)48.6±4.1 49.2±4.1 51.5±4.3 45.8±3.6 BUN(mmol/L)8.37±0.86 8.37±0.79 10.68±1.01 7.56±0.81 GLU(mmol/L)5.26±0.43 5.37±0.45 5.89±0.59 4.98±0.39 TC(mmol/L)1.25±0.30 1.27±0.33 1.75±0.42*1.18±0.08血液生化指标TG(mmol/L)0.73±0.06 0.77±0.07 1.02±0.15*0.51±0.05

2.5.4 病理学检查 在组织病理学检查中，观察各剂量组相对于溶剂对照组的动物脏器是否具有明显改变。结果发现，在外观、大小等各方面，心、肝、脾、肺、肾、胃肠等重要脏器均正常，未见明显的毒性病理改变。

3 讨论

根据以上毒理学实验结果，证实了山梨酸钾对动物机体无毒害，加上其具有较广的抗菌谱，对霉菌、酵母菌等均有抗菌性，是一种典型的酸性防腐剂，在人体正常的代谢下，大部分会代谢生成二氧化碳和水从人体排出。本实验中通过对小鼠进行急性毒性实验，得到其LD50=1 300 mg/kg，表示山梨酸钾为低毒级物质；通过骨髓细胞微核试验，证实山梨酸钾无致突变的作用；在小鼠精子畸形试验中也证实了本品无遗传毒性及潜在的致癌作用；通过传统致畸试验显示本品无致畸作用；在急性毒性试验的基础上，通过30 d喂养试验，对动物体重和食物摄取量的观察，RBC、WBC等血液学指标以及ALT、BUN、GLU、TC、TG等血液生化学指标的分析，对肝、肾、脾、胃肠等重要脏器进行组织病理学检查，进一步证明山梨酸钾对动物机体无毒害。

本实验中，血清生化指标中胆固醇有随试验剂量增高而增高的趋势，但无剂量反应关系，而且山梨酸钾浓度过大，实际用量将稀释许多倍，但为安全起见，建议进一步做大鼠90 d喂养等试验，以长期对山梨酸盐进行更深入细致的研究。

毒理学安全评价是衡量食品添加剂毒性大小的重要依据，各种添加剂能否使用以及使用范围和最大使用量应严格按照《食品添加剂管理办法》的规定操作，以保证其在安全范围内使用。中国卫生部发布的《食品添加剂使用卫生标准》中有规定，山梨酸钾在不同食物中的使用量是在0.075～2.01 g/kg的范围内，这个限量相对于日本的《食品卫生法》和世界卫生组织联合国粮食及农业组织制定的《国际食品法典委员会(CAC)标准》中的规定限量远远偏低。当然，各国制定的标准可能与每个国家的饮食、环境、生活方式等的不同有很大的关系。

综上所述，可以断定山梨酸钾是安全的，可作为食品、药品、饲料等领域的防腐剂，商业前景十分广泛。

[1] 郑俊民.药用辅料手册[M].北京:化学工业出版社,2005:581-583.

[2] 中华人民共和国卫生部.食品安全性毒性学评价-食品安全性毒理学评价程序.中华人民共和国国家标准,GB15193.1-2003.

[3] 中华人民共和国卫生部.食品安全性毒性学评价-急性毒性实验.中华人民共和国国家标准,GB15193.3-2003.

[4] 中华人民共和国卫生部.食品安全性毒性学评价-骨髓细胞微核试验.中华人民共和国国家标准,GB15193.5-2003.

[5] 中华人民共和国卫生部.食品安全性毒性学评价-小鼠精子畸形试验.中华人民共和国国家标准,GB15193.7-2003.

[6] 中华人民共和国卫生部.食品安全性毒性学评价-致畸试验.中华人民共和国国家标准,GB15193.14-2003.

[7] 中华人民共和国卫生部.食品安全性毒性学评价-90天和30天喂养试验.中华人民共和国国家标准,GB15193.13-2003.