超高效液相色谱串联质谱法测定银杏叶中氨基甲酸酯类农药残留

刘雪，卢蕾，马金凤，李亮亮，李丽霞，赵志强，许志强，吴成，王明林

（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安 271018； 2.山东省农业环境保护总站，济南 250100）

超高效液相色谱串联质谱法测定银杏叶中氨基甲酸酯类农药残留

刘雪1，卢蕾1，马金凤1，李亮亮1，李丽霞2，赵志强2，许志强2，吴成2，王明林1

（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安 271018； 2.山东省农业环境保护总站，济南 250100）

建立了银杏叶中15种氨基甲酸酯类农药残留量的超高效液相色谱–串联质谱测定方法。样品经乙腈提取，TPT固相萃取柱净化，通过XTerra MS C18色谱柱分离，供串联质谱测定。15种氨基甲酸酯类农药在0.02～0.5 mg/L范围内线性良好，相关系数为0.996 2～0.999 9；在0.004，0.01，0.02，0.04 mg/kg 4个添加水平下，其平均回收率为65.22%～96.66%，相对标准偏差为1.43%～10.06%（n=5）。该方法净化效果好、灵敏度高、重现性好，可满足银杏叶中15种氨基甲酸酯类农药残留量的检验要求。

液相色谱–串联质谱法；氨基甲酸酯类；农药残留；银杏叶

氨基甲酸酯类农药是继有机氯、有机磷类农药后发展较为迅速的一类高效、广谱杀虫剂，具有杀虫效果显著、分解快、代谢迅速、残留期短等特点［1，2］，此外还常被作为杀菌剂、除草剂和生长调节剂。由于部分有机氯农药的限制使用以及抗药性昆虫品种的增加，氨基甲酸酯类农药使用量逐年增加，其在作物上的残留对人体健康的危害以及对环境的破坏越来越受到人们的关注。

目前，对氨基甲酸酯类农药残留的分析方法主要有HPLC，GC–MS，HPLC–MS等［3–11］。由于该类化合物极性强，热稳定性较差，有些物质在气相色谱分析的温度下发生分解，用GC或GC–MS分析不理想；液相色谱荧光检测法需要经过衍生化才能进行测定，操作繁琐，分析时间长，消耗的溶剂量较大；超高压液相色谱配以串联质谱技术具有分析效率高、分析时间短、灵敏度高的特点，能够满足进出口对氨基甲酸酯类农药残留的检测要求。

银杏叶提取物对预防和治疗心脑血管等疾病有显著效果，并具有抗痴呆及延缓衰老的功能。在银杏种植过程中，为防治昆虫的侵害，人们大量使用农药，从而引起农药残留问题。随着国外技术壁垒的提高，欧盟和美国，尤其是日本肯定列表制度实施后，对银杏叶出口农药残留检测要求更高，大大制约了我国银杏叶的出口。为了克服国外技术壁垒，笔者利用固相萃取技术，结合液相色谱–串联质谱法建立了银杏叶中15种氨基甲酸酯类农药残留的分析方法。结果表明，该方法简便、灵敏高、净化效果好，可满足银杏叶中常用的氨基甲酸酯类农药残留量的检验需要。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱：ACQUITY Ultra PerformanceLC型，美国Waters公司；

质谱仪：Micromass Quattro Ultima IMPT型，美国Waters公司；

高速匀浆机：T–25 basic型，德国IKA公司；

高速离心机：3K30型，美国Sigma公司）；

旋转蒸发仪：Laborota 4000型，美国Heidolph公司；

氮吹仪：N–EVAP 112型，美国Organomation公司；

固相萃取柱：TPT，2 000 mg/（12 mL）；

乙腈、甲苯：分析纯；

甲醇：色谱纯；

乙酸铵：优级纯；

实验用水为新制备的二次蒸馏水；

农药标准品：纯度大于99%，德国Dr.Ehrenstorfer公司；

标准储备溶液：吸取适量的15种氨基甲酸酯类农药标准物质，分别用甲醇稀释成100 mg/L标准储备溶液，保存于0～4℃冰箱中；

标准工作溶液：吸取适量15种氨基甲酸酯类农药标准储备溶液，用甲醇稀释成10 mg/L混合标准溶液，于0～4℃冰箱保存。

1.2 仪器条件

色谱条件 XTerra MS C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；柱温：40℃；进样量：5 μL；梯度洗脱条件如表1所示。

表1 梯度洗脱条件

质谱条件 电喷雾离子源ESI（+）；多重反应监测方式（MRM）；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：110℃；脱溶剂温度：400℃；脱溶剂气流量：500 L/h；锥孔气流量：80 L/h；定性离子、定量离子、锥孔电压和碰撞能量见表2。

1.3 实验方法

称取样品5.0 g于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，均质1 min，以4 000 r/min转速离心5 min，上清液完全转移至50 mL离心管中，滤渣再用10 mL乙腈均质提取一次，离心后合并上清液于同一50 mL离心管中，置于–20℃冰箱中冷冻2 h，取出后迅速以4 000 r/min冷冻离心3 min，将上清液全部转移至旋转蒸发瓶中，于40℃水浴下旋转蒸发浓缩至1～2 mL，待净化。

表2 种氨基甲酸酯类农药的质谱条件

将浓缩液转移入用10 mL乙腈–甲苯（体积比为3∶1）活化的TPT柱（柱前加2 cm无水硫酸钠），当浓缩液液面达到固定相顶端时，用25 mL乙腈–甲苯（体积比为3∶1）混合溶液洗脱被测物，收集全部洗脱液于旋转蒸发瓶，并浓缩至近干，氮气吹干。用1.0 mL乙腈溶解，过0.22 μm微孔滤膜，待测。

2 结果与讨论

2.1 样品提取条件的优化

考察了乙腈、乙腈–甲苯（体积比为3∶1）、丙酮–正己烷（体积比为1∶4）、乙酸乙酯–正己烷（体积比为1∶1）4种常见提取溶剂的提取效果。结果表明，丙酮–正己烷、乙酸乙酯–正己烷去油效果差，与正己烷溶解部分油脂有关；乙腈和乙腈–甲苯相比较，乙腈提取的回收率更高，所以选用乙腈为提取液。

对比了提取溶剂用量分别为10，20，30，40 mL时对提取效果的影响。发现提取溶剂用量为30 mL时提取效果最佳，40 mL时溶出的样品杂质、油脂较多。因此实验选择30 mL乙腈为提取溶剂。

离心后的样品出现油状物质，严重干扰了被测物。为不影响后续实验，选用净化前加正己烷、净化后加正己烷以及冷冻除脂的方法，去除油状物质。结果表明，正己烷除脂效果差，且部分被测物溶于正己烷而降低回收率。采用均质后冷冻2 h再冷冻离心的效果最好，能满足试验要求。

2.2 样品净化条件的优化

2.2.1 固相萃取柱的选择

对于极性较大的氨基甲酸酯类农药残留的分析，采用液–液分配法净化后，回收率往往很低，具有很大的局限性，目前较多采用固相萃取技术进行净化。通过查阅相关文献，选取C18柱、NH2柱、PSA柱、石墨化炭黑/氨基柱、TPT柱进行对比试验。结果发现，C18柱、NH2柱去除色素效果较差，净化后色素较深；PSA柱和石墨化炭黑/氨基柱虽能去除大部分色素，但回收率远不如TPT柱；经TPT柱净化后的收集液呈透明状，且回收率符合要求。因此实验选用TPT柱净化。

2.2.2 洗脱液及其用量的选择

分别考察了乙腈、乙腈–甲苯（体积比为3∶1）、丙酮–正己烷（体积比为1∶4）、乙酸乙酯–正己烷（体积比为1∶1）各25 mL时的洗脱效率。结果表明，乙腈–甲苯混合溶液作为洗脱液时，测得的各农药的回收率优于其它3种洗脱液。因此选用乙腈–甲苯混合溶液作为洗脱液。

分别采用10，20，25，30 mL洗脱液洗脱，考察15种氨基甲酸酯类农药回收率。结果表明，洗脱液超过25 mL时，部分农药回收率过高，说明过量的洗脱液将部分杂质洗脱下来，影响了农药的检测。因此确定洗脱液体积为25 mL。

2.3 色谱条件的优化

2.3.1 流动相的选择

实验采用了不同配比的乙腈–甲酸水（0.1%）、甲醇–甲酸水（0.1%）、乙腈–乙酸铵（1 mmol/L）、甲醇–乙酸铵（1 mmol/L）作流动相，当有机相为乙腈时，由于乙腈的洗脱能力更强，分析物无法得到充分的分离，所以有机相选择甲醇。甲醇–乙酸铵（1 mmol/L）比甲醇–甲酸水（0.1%）洗脱的分析物响应值高，灵敏度更好，故实验选择了甲醇–乙酸铵（1 mmol/L）作为流动相。实验比较了不同的梯度程序，残杀威和克百威（保留时间分别为6.20 min和6.26 min）、硫双威和抗蚜威（保留时间分别为6.96 min和7.09 min）未能得到有效分离，但采用多反应监测模式（MRM）可避免相互干扰，不影响测定结果。

2.3.2 质谱条件的选择

采用1.0 mg/L氨基甲酸酯类农药标准溶液以流动注射的方式在正离子模式下进行母离子全扫描，调节电离电压和锥孔电压，确定各氨基甲酸酯类农药的分子离子，然后对其子离子进行全扫描，优化子离子及碰撞能量，确定其中选择性最强的两个子离子作为监测离子。图1为15种氨基甲酸酯类农药（质量浓度均为0.2 mg/L）的总离子流色谱图。

图1 标准品MRM总离子流色谱图

2.4 线性方程

以空白基质配制0.02，0.05，0.1，0.2，0.5 mg/L标准溶液，在选定的色谱和质谱条件下进行测定，以进样浓度X(mg/L)为横坐标，峰面积Y为纵坐标进行线性回归，线性方程和相关系数见表3。

表3 15种氨基甲酸酯类农药线性方程、LOD和LOQ

2.5 方法的回收率和精密度

在银杏空白样品中分别添加混合标准品0.004，0.01，0.02，0.04 mg/kg 4个水平，每个水平重复测定5次，测定结果见表4。银杏叶4个添加浓度平均回收率硫双威为65.22%～72.74%，其它为76.18%～96.66%，相对标准偏差为1.43%～10.06%，表明该方法具有较好的精密度和准确度。15种氨基甲酸酯类农药在银杏叶中的检出限（LOD）和定量限（LOQ）见表3。

实验中除了硫双威外的分析物回收率都在农残分析要求范围内，硫双威回收率低可能由于在净化过程中与TPT柱内的填料产生较强的吸附，洗脱液很难将其洗脱下来。

表4 各浓度添加回收率

续表4

2.6 实际样品测定

用所建立的方法对从基地上购买的银杏叶进行处理和实际测定，所测样品中15种氨基甲酸酯类农药组分均未检出。

3 结论

建立了银杏叶中15种氨基甲酸酯类农药残留量的高效液相色谱–串联质谱检测法，获得了满意的分离效果和检测灵敏度，方法准确性和重复性好、灵敏度高，能满足银杏叶出口检测需要，符合残留分析质量控制指南的要求。

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Determination of Carbamate Pesticides Residue in Ginkgo Leaves by UPLC–MS–MS

Liu xue1， Lu Lei1， Ma Jinfeng1， Li Liangliang1， Li Lixia2， Zhao Zhiqiang2, Xu Zhiqiang2， Wu Cheng2， Wang Minglin1
(1. College of Food Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Tai’an 271018， China； 2. Agro-environment Protection Station of Shandong Province， Jinan 250100， China)

15 carbamate pesticides residue in ginkgo leaves were determined by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC–MS–MS). The sample was extracted with acetonitrile，which was concentrated and puri fi ed by TPT solid-phase extraction column. The eluate was separated on XTerra MS C18column，and used for tandem MS analysis. The recoveries of the 15 carbamate pesticides in ginkgo leaves (from 0.004 to 0.04 mg/kg) ranged from 65.22% to 96.66% with the relative standard deviations of 1.43%–10.06%(n=5). The linear correlation coef fi cient was 0.996 2–0.999 9. The method has good puri fi cation effect, reproducibility and high sensitive. It can meet the requirements for the simultaneous determination of 15 carbamate pesticides residue in ginkgo leaves.

UPLC–MS–MS; carbamate; pesticide residue; ginkgo leaf

O657.63

A

1008–6145(2012)03–0060–05

10.3969/j.issn.1008–6145.2012.03.016

联系人：王明林；E-mail: mlwang@sdau.edu.cn

2012–03–15