抗猪繁殖与呼吸综合征高免血清的研制

李海昌，白卫兵＊，杨培昌，高自寿，何从忠

（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明 650201；2.楚雄州动物疫病控制中心，云南 楚雄 675000；3.云南南华县动物疫病控制中心，云南 南华 675200）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸衰竭为主要症状的传染病，临床症状主要表现为母猪流产、早产、产死胎、产木乃伊胎、仔猪成活率下降和育成猪呼吸道症状等[1]。据报道，高致病性猪蓝耳病在我国仔猪发病率可达100%、死亡率可达50%以上，母猪流产率可达30%以上[2]。自2007年以来，我国有26个省份先后发生了高致病性猪蓝耳病疫情，对我国的养猪业造成了极大的危害和重大的经济损失[3]。由于猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫机理复杂、免疫效果较差，加之该病毒感染猪体后可造成长期持续性感染和隐性感染，使猪蓝耳病疫情在我国部分地区时有发生。此病目前尚无特效药物可以进行治疗，主要采取对症疗法和综合性的控制继发感染措施，但效果有限。在疫病发生早期，高免血清配合疫苗使用是预防和治疗传染病的有效措施之一[4]。由于高免血清中含有较高的针对病原的特异性抗体，能与体内相应病原发生特异性中和作用，从而有效地抑制病原的致病作用，使机体恢复健康。因此，高效价、高特异性的抗蓝耳病免疫血清对控制、预防和治疗猪蓝耳病具有重要意义。本试验对猪繁殖与呼吸综合征高免血清的制备及其临床应用进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 抗原 猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗，由北京中农生物工程开发中心生产；猪繁殖与呼吸综合征弱毒苗，由哈尔滨维科生物技术开发公司生产，均购于云南省动物疫病控制中心疫苗服务部。

1.1.2 试验用动物 6头同一品种健康育肥猪。

1.1.3 试剂和仪器 猪繁殖与呼吸综合征抗体快速检测卡，购于深圳市康百得生物科技有限公司；猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒，购自武汉科前动物生物制品有限责任公司；青霉素、链霉素，由云南生物制药厂生产；双蒸水、灭菌生理盐水等，由成都军事医学研究中心提供；超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、低温冰箱、离心机、酶标仪（Biorad）、MB病毒灭活过滤器、分装器等，均由成都军事医学研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将6头同一品种健康育肥猪随机分为2组，分别为等量法加强免疫组和倍增法加强免疫组，每组3头。

1.2.2 免疫方法 免疫程序分为基础免疫和加强免疫。

基础免疫：基础免疫的免疫原为10头份装猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗，每头猪肌肉注射1.5头份。加强免疫：于基础免疫接种后2周进行。等量法加强免疫组，每头猪每次注射2头份弱毒疫苗，免疫间隔期7d，共加强免疫4次；倍增法加强免疫组，也加强免疫4次，免疫间隔期7d，但第1次加强免疫每头猪注射2头份弱毒疫苗，第2次加强免疫注射4头份，第3次注射8头份，第4次注射16头份。

1.2.3 采血及分离血清 在末次免疫后的第3天进行采血，耳静脉采血，37℃温育1h后，2000 r／min离心10min，吸取血清。用猪繁殖与呼吸综合征抗体快速检测卡，检测免疫血清初步效价，初步效价达到1∶80以上为合格。

初步效价检测合格后第7天采血（即末次免疫后的第10天），停食12h后，颈动脉放血收集血液于密闭容器中，加入青霉素和链霉素，置于室温下1 h左右，待凝固后，置4℃过夜析出血清，4000 r／min离心15min，在无菌条件下分离血清，病毒灭活过滤器过滤后分装为5mL／支。检测合格后，冷冻储存、备用。

1.2.4 血清效价的检测 用猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒检测血清抗体效价，操作方法和判断方法均按照试剂盒说明书和郭一等[5]报道的方法进行。

1.2.5 安全性检测 对高免血清进行无菌检验和动物试验以检测其安全性。

1.2.5.1 无菌检验 取少量制备的抗血清，接种于普通琼脂平板和血斜面培养基，置37℃水浴锅培养48h，观察结果。

1.2.5.2 动物试验 选取健康仔猪、育肥猪、后备母猪各2头，将制备好的高免血清对仔猪和育肥猪每头颈部肌肉注射5mL、后备母猪静脉注射10 mL，然后连续测量体温14d并观察其健康状况。

1.2.6 临床应用试验 按农业部公布的猪繁殖与呼吸综合征发病猪的判定标准为诊断依据，发病1周以内判定为早期病例，发病1周以上判定为中后期病例。选取同一猪场诊断为猪繁殖与呼吸综合征的繁育母猪，早期病例和中后期病例各30例进行治疗试验。每头每次静脉注射10mL制备的高免疫血清，同时为了防治细菌性病原体的混合感染和继发感染，还应用了抗生素及解热镇痛药，进行控制感染和对症治疗。

2 结果

2.1 血清效价检测

从表1可看到，于末次免疫后第3天检测免疫血清的初步效价，结果等量法加强免疫组3头猪抗体初步效价均为1∶80，而倍增法加强免疫组3头猪抗体初步效价都是1∶320。于末次免疫后第10天，检测抗血清的终效价，结果等量免疫组3头猪都是1∶160，而倍增法免疫组3头猪抗血清效价迅速达到1∶640。

表1 猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫血清的效价检测结果Table1 The test results of immune serum titre against PRRSV

2.2 安全性检测结果

将制备的血清分别接种普通琼脂平板和血斜面培养基48h后均无任何细菌生长，表明样品无菌检验合格。仔猪、育肥猪及后备母猪应用制备的免疫血清后均无过敏现象，也无外观症状和病理变化。体温正常，无发热现象，精神状态良好，食欲正常。

2.3 临床应用试验结果

60例病猪用制备的猪蓝耳病高免血清静脉注射治疗均未出现不良反应；早期病例30例，经1次治疗后治愈27例，经2次治疗后又治愈3例；中后期的病例30例，经2次治疗治愈19例，经3次治疗又治愈2例，经4次治疗又治愈1例，其余8例死亡。总有效率达86.67%（52／60）。

3 讨论

本试验所使用的抗原为正规厂家生产的猪繁殖与呼吸综合征灭活苗和弱毒苗，确保了抗血清制备过程中的生物安全性。试验未用强毒进行攻毒，而是选用安全可靠的灭活苗和弱毒苗作为免疫原，最终获得了抗体效价满意的免疫血清。

制定合理的免疫程序是获得高效价免疫血清制备的关键[6]。为了比较不同免疫程序对抗体水平的影响，试验中基础免疫都用猪繁殖与呼吸综合征灭活苗作为抗原，而强化免疫时参照文献资料[7－9]，制定了等量法和倍增法两种加强免疫方案。不同的免疫程序，由于抗原在体内的的代谢速度不同，对免疫系统的刺激强弱也不同，因而产生抗体的水平也就不同[10－12]。结果倍增法免疫产生的抗体水平比等量法高，但二者相比，等量法所用的抗原量又比倍增法少。所以，两免疫方案各有利弊。

为了确保制成的免疫血清的安全性，本试验还进行了抗血清成品的无菌检验和动物安全性试验。结果成品无菌检验合格，动物安全性试验表明产品安全性良好。

试验结果表明，应用猪繁殖与呼吸综合征灭活苗和弱毒苗作为免疫原按一定免疫程序免疫健康育肥猪，所制备的免疫血清效价最高者可达1∶640，临床病例治疗有效率达86.67%。因此，采用该方法制备猪繁殖与呼吸综合征高免血清是安全有效、切实可行的，而且成本低廉，在生产实际中具有一定的应用前景。

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