胚胎干细胞研究进展

文│闫益波 王福传 李文刚（山西省农业科学院畜牧兽医研究所）

胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ES细胞）是一种从早期胚胎的囊胚内细胞团（Inner Cell Mass，ICM）细胞或胎儿原始生殖细胞（primordial germ cells，PGCs）经分离、体外抑制分化培养得到的具有发育全能性（或多能性）的细胞。近年来，干细胞研究领域不断有所突破，1999年发现了成体干细胞具有跨系跨胚层分化的“可塑性”；尤其值得一提的是，最近由体细胞获得的诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPS细胞）具有和ES细胞几乎一样的生物学特性，进一步推动了全世界干细胞研究的热潮。

一、ES细胞的生物学特性和研究价值

一方面，ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞体积小，核大，核质比高，有一个或多个核仁，核型正常，具有整倍性。ES细胞体外培养时呈鸟巢集落状生长，细胞紧密堆积，难以看清细胞轮廓，集落边界清晰，有立体感。

另一方面，ES细胞还具有细胞系的特征，可以在体外长期传代、冷冻保存、核移植和遗传操作等。ES细胞在功能上的主要特征就是无限自我更新和高度的分化潜能。

一般来讲，细胞多能性检测的方法主要有：①体外悬滴培养诱导形成类胚体实验，即将ES细胞培养在不含分化抑制物的培养基上，可以形成类胚体（embryoid bodies，EB）。②体外特定条件下诱导分化成任一胚层细胞实验，将ES细胞在特定培养基进行培养，定向分化成任一胚层的特定组织。③体内皮下畸胎瘤实验，将ES细胞悬液注射入同源动物皮下，形成组织瘤，包含三胚层细胞的混杂细胞群体。④体内胚胎嵌合种系传递实验，将ES细胞与胚胎细胞共同培养或者将ES细胞注射入囊胚腔中，ES细胞就会参与多种组织发育。ES细胞多能性检测还可以对维持细胞多能性相关的重要转录因子（Oct4、Sox2、Nanog等）进行检测或者对ES细胞的相关蛋白分子标记物检测。

ES细胞的分离培养建系是胚胎生物技术领域的重大成就，同时也是现代生物技术研究的热点和焦点，ES细胞特有的生物学特性，决定了其在生物学领域有着不可估量的应用价值。基础方面主要应用于研究基因功能、细胞分化和个体发育，应用方面主要是作为组织工程中重要的种子细胞用于损伤和疾病组织的修复和替代治疗研究。同时，它在药理和毒理研究方面也具有重要作用；对于动物生产而言，在核移植、嵌合体、转基因动物研究方面也进行了广泛的尝试，已经充分体现出ES细胞在加快良种家畜繁育、生产转基因动物、建立哺乳动物发育模型、基因和细胞治疗等方面有着广阔的应用前景。

二、ES细胞的最新进展：iPS细胞

iPS细胞是将维持ES细胞多能性相关的一些核心基因（Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc，Nanog和Lin28等）转导入非多能性的细胞（各种终末分化的体细胞或者成体干细胞）后产生的类似多能性ES细胞的特殊细胞类型（图1）。为了提高iPS细胞技术的效率及安全性，研究围绕着筛选标记、载体系统、转导基因的种类、体细胞类型和一些可以促进效率提高的化合物筛选等展开，目前进展很快。iPS细胞在不断朝着简便、高效和安全的方向快速发展，与ES细胞的方向一样，iPS细胞的诱导分化及其可能的生物医学研究也在不断拓展。

iPS细胞的产生证实了分化的细胞可以通过少数几个因子的外源导入而被重编程到多能状态，为进一步研究多能性的调控机制提供了新的研究模型，这种全新的体细胞核重编程的方法在基础研究和临床应用方面具有极其重大的意义。尽管制造iPS细胞的方法近来不断优化，但目前对iPS细胞产生的具体分子机制还不十分清楚。同时，这种方法重编程的效率依然较低，虽然已有一些动物实验初步显示了iPS细胞的临床潜能，但是安全问题依然有待评估，所以iPS细胞应用于临床尚待时日，尤其是要深化对iPS细胞产生机理的研究。

图1 iPS细胞技术简图

三、ES细胞研究的重点领域

1.ES细胞的分离培养建系。通过完善ES细胞的分离、培养、扩增、鉴定和冷冻保存技术来研究不同物种、不同方法的ES细胞建系的效率和质量，进一步严格规范ES细胞标准，提高不同ES细胞的同质性。

2.ES细胞自我更新的分子机制。通过对ES细胞全能性维持和调节研究来阐明ES细胞自我更新的分子机制，这主要是通过细胞内外的相关细胞信号通路来实现的，是研究ES细胞干性及分化的基础。

3.ES细胞诱导分化及其机制。研究ES细胞向一些重要组织的祖细胞或者终末分化细胞诱导分化，提高诱导分化的效率和分化后细胞的纯化。

4.iPS细胞的建立及其与ES细胞关系。通过对不同物种不同组织的细胞进行诱导重编程，进一步研究重编程的机理，并且比较iPS细胞与ES细胞的异同。

5.细胞多能性的获取及其表观遗传学机制。

体细胞重编程从而重新获得多能性的过程是一个表观遗传学的过程，通过对体细胞克隆、细胞融合以及iPS细胞的研究可以揭示其中的表观遗传学机理。

四、ES细胞研究面临的主要问题

首先就是不同物种甚至不同品系的建系效率和质量有较大的差异，这其中的原因还没有充分研究清楚，从而导致一些物种的ES细胞不能建立或者说研究结果稳定性较差。第二是ES细胞维持多能性无限增殖和诱导分化的分子机制有待于进一步阐明。第三是各种诱导分化策略技术体系还不完善和成熟，尤其是诱导分化后靶细胞的分离纯化方法和效果还需要不断研究。第四就是ES细胞容易导致畸胎瘤的出现，所以其应用的安全性问题一直备受关注，这也是ES细胞应用最为迫切需要解决的一个问题。第五就是由于ES细胞来源涉及早期胚胎，对人而言，面临着诸多伦理、道德和法律等方面的争议。第六是ES细胞作为再生医学最重要的种子细胞，尽管拥有很大的优势，但是作为一种异源细胞，免疫排斥的问题尚未很好解决。最后，在ES细胞的培养体系中，由饲养层、血清、动物源性成分导致的培养成分不明和可能的交叉污染也是近年来ES细胞研究中的一个热点问题。