吉非贝齐对人巨噬细胞Kv1.3和Kir2.1表达的差别调节作用及其对膜电位的影响

2012-06-20雷新军林显丰王东琦袁祖贻

吉林大学学报（医学版） 2012年5期

雷新军，张葳，林显丰，王东琦，袁祖贻，4

（1.西安交通大学医学院第一附属医院心内科，陕西西安 710061；2.西安交通大学医学院第一附属医院新生儿科，陕西西安 710061；3.美国印第安纳大学医学院普渡心脏病学研究所，印第安纳波利斯 46202；4.西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室，陕西西安 710061）

雷新军1，张葳2，林显丰3，王东琦1，袁祖贻1，4

目的：探讨人巨噬细胞发育过程中Kv1.3、Kir2.1通道的表达和吉非贝齐的调节作用，观察其对膜电位的影响，为动脉粥样硬化（AS）相关性疾病治疗提供电生理学依据。方法：健康人外周血单核细胞源性巨噬细胞随机分为对照5d组（C 5d）、对照7.5d组（C 7.5d）和吉非贝齐组（G），吉非贝齐的终浓度为400μmol·L－1；采用Real time RT－PCR及Western blotting技术检测Kv1.3和Kir2.1通道的表达，电压敏感染料膜电位标测技术分析膜电位的变化。结果：与C 5d组比较，C 7.5d组 Kv1.3mRNA／蛋白水平从（1.064±0.275）／（0.227±0.018）升高至（3.067±0.824）／（0.409±0.022）（P＜0.05），但 Kir2.1mRNA／蛋白水平却从（1.024±0.166）／（0.204±0.018）降低至（0.399±0.133）／（0.042±0.008）（P＜0.05）；与 C 7.5d组比较，吉非贝齐组 Kv1.3 mRNA／蛋白水平下降至（1.137±0.067）／（0.143±0.023）（P＜0.01），而 Kir2.1mRNA／蛋白水平却升高至（1.35±0.087）／（0.202±0.033）（P＜0.01）；吉非贝齐显著消弱C 5d和C 7.5d组巨噬细胞表面的荧光强度，使其膜电位从（1.000±0.026）分别下降至（0.833±0.046）和（0.481±0.053）（P＜0.05）。结论：吉非贝齐差别调节人单核细胞源性巨噬细胞Kv1.3和Kir2.1通道的表达，并降低巨噬细胞膜电位。

离子通道；膜电位；巨噬细胞；吉非贝齐；细胞分化

目前认为，过氧化物酶体增生物激活受体α（peroxisome proliferator－activated receptor－alpha，PPARα）激动剂吉非贝齐（gemfibrozil）对伴有血脂异常的患者能够改善心血管临床转归［1］。吉非贝齐不仅通过增加高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL－C）、降低甘油三酯（triglyceride，TG）、上调对胆固醇逆向转运（reverse cholesterol transport，RCT）关键的基因表达［2］等机制减少罹患动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）患者的临床事件，而且其代谢产物 M1（5－（4－hydroxy－2，5－dimethyl－phenoxy）－2，2－dimethyl pentanoic acid）能剂量依赖性抑制低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）的氧化修饰，减弱氧化修饰低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，OxLDL）的细胞毒性作用［3］。

巨噬细胞通过A族清道夫受体（scavenger receptor class A，SR－A）、B 族清道夫受体（scavenger receptor class B，SR－B）如 CD36等无限制摄取氧化脂质导致泡沫细胞形成，是AS斑块始发与进程中的关键环节［4］。抑制巨噬细胞向泡沫细胞分化被认为是抗AS药物筛选及防治机制研究的重要途径。研究［5］显示：吉非贝齐可以显著减少ApoE（－／－）鼠AS损害面积。但是，其对巨噬细胞的功能和分化有无影响及其可能机制目前尚不清楚。离子通道（ion channel）是细胞维持生命活动的结构基础。近年来的研究［6－7］表明：电压依赖性钾通道（voltage－dependent potassium channel，VDPC）Kv1.3和内向整流钾通道（inward rectifier potassium channel，Kir）Kir2.1在人外周血单核细胞源性巨噬细胞的泡沫化过程中发挥着关键的调控作用，有望成为AS防治的一类崭新的分子靶点。然而，迄今为止国内外尚未见有关吉非贝齐对巨噬细胞Kv1.3和Kir2.1表达及功能影响的报道。本研究采用Real time RT－PCR和 Western blotting技术观察吉非贝齐对人单核细胞源性巨噬细胞Kv1.3和Kir2.1表达的调节作用，并采用电压敏感染料膜电位标测技术进一步分析其对巨噬细胞膜电位的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂及主要仪器吉非贝齐购自Sigma公司，RPMI－1640 培养基购自 Gibico 公司，di－4－ANEPPS购自 Molecular Probes公司，兔抗人Kv1.3和Kir2.1多克隆抗体购自 Alomone Labs公司，BCA蛋白定量试剂盒购自陕西先锋生物技术有限公司，RNAfast200试剂盒购自上海飞捷生物技术有限公司，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kits和Real time PCR Master Mix购自Fermentas公司，UnBlotTM胶内化学发光检测试剂盒购自Pierce公司。CK40－32P倒置相差显微镜为Olympus公司产品；IQ5.0实时定量PCR仪、蛋白垂直电泳槽和蛋白湿转仪为Biorad公司产品；电泳仪为北京六一公司产品。引物由北京三博远志生物技术有限公司合成。

1.2 细胞培养采用密度梯度离心法从健康志愿者献血、中心血库机采血小板后的剩余成份中分离单核细胞，培养5d即分化为巨噬细胞。随机分为3组：①对照5d组（C 5d），不添加任何试剂，即刻收获；②对照7.5d组（C 7.5d），含10%胎牛血清的RPMI－1640培养基；③吉非贝齐组（G），吉非贝齐的终浓度为400μmo·L－1。后2组细胞于培养60h后收获。上述细胞均检测钾通道表达，而C 5d和C 7.5d组细胞还进一步检测膜电位。所有实验中，台盼蓝排除实验检测细胞活力均大于95%。

1.3 RNA提取和Real time RT－PCR反应采用RNAfast200试剂盒提取细胞总RNA和RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kits合成cDNA，Real time PCR Master Mix进行PCR。反应条件：50℃、2min；95℃、10min；95℃、15s，60℃、30s，72℃、30s，共40个循环。循环结束后进行溶解曲线分析，从55℃开始到95℃，每0.5℃读取数值1次，结果显示为单一峰。所有PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳均证实为特异性条带。各引物序列及扩增产物片段如下：Kv1.3（NM ＿002232.3），F：5′－ACTGCTGGTGCGGTTCTTCG －3′，R：5′－TGTCCATTGCCCTGTCGTTCG－3′，扩增产物 138bp；Kir2.1 （NM ＿000891.2），F：5′－TCAGAAGAAGACGGTATGAAGTTGG－3′， R： 5′－CAGGCAGAAGATAACCAGCATCC－3′，扩增产物 231bp；内参β－actin（NM ＿001101.3），F：5′－ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG－3′， R： 5′－AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG－3′，扩增产物179bp。目的基因拷贝数以2－△△c（t）法计算。

1.4 蛋白提取和 Western blotting检测收集细胞，加500μL冰预冷的巨噬细胞裂解缓冲液（1%Nonidet P－40，10%glycerol，50mmol· L－1HEPES，pH 7.5，150mmol · L－1NaCl，1mg·L－1抑肽酶，1mg· L－1亮抑酶肽，86mg·L－1碘乙酰胺和1mmol·L－1苯甲基磺酰氟化物）裂解细胞。4℃离心，12 000g×10min，吸取上清，测定蛋白浓度后，－80℃保存。上样前煮沸样品5min，然后10%SDS－PAGE 100V×1.5h电泳和4℃、30V湿法转膜过夜。含5%脱脂奶粉的TBS室温封闭90min后，兔抗人Kv1.3和Kir2.1多克隆抗体孵育，4℃过夜；TBS－T洗涤，15min×4，1∶500二抗室温孵育1h；增强的化学发光法检测Kv1.3和Kir2.1。蛋白的表达水平以其与β－actin累积光密度值（IOD）的比值表示。

1.5 电压敏感染料膜电位标测技术测定膜电位细胞种植于6孔板，实验开始时吸去培养液并用细胞外液（mmol·L－1：NaCl 140，KCl 4，MgCl21，CaCl22，D－Glucose 5，HEPES 10，NaOH 调节pH值至7.4）清洗1次，然后加入1∶1 000 di－4－ANEPPS 200μL，孵育30s，吸干染料后再加入细胞外液1mL并开始记录。记录采用CK40－32P倒置相差显微镜，连续拍摄（曝光时间20ms，间隔时间1s），并同时使用Image－pro－plus图像采集软件记录荧光强度的改变。吉非贝齐干预组在拍摄3～7s时给药并记录。荧光强度通过LabVIEW 7.1分析软件转换为Excel数据并分析。

1.6 统计学分析以Excel软件建立数据库，采用SPSS 13.0统计软件进行数据统计分析。Kv1.3和Kir2.1mRNA和蛋白的表达水平以x±SE表示，采用方差分析（ANOVA）进行组间比较，比较前进行方差齐性检验，组间两两比较采用LSD－t检验。

2 结果

2.1 Kv1.3mRNA及蛋白的表达在巨噬细胞发育过程中，Kv1.3的表达被显著上调，与C 5d组比较，C 7.5d组巨噬细胞Kv1.3mRNA和蛋白增加分别接近3和2倍，差异有统计学意义（P＜0.05）；而400μmol·L－1吉非贝齐显著抑制巨噬细胞Kv1.3的表达，同C 7.5d组比较，吉非贝齐组Kv1.3mRNA和蛋白表达下降均超过60%（P＜0.01）。见表1和图1。

2.2 Kir2.1mRNA及蛋白的表达在巨噬细胞发育过程中，Kir2.1的表达被显著下调，同C 5d组比较，C 7.5d组巨噬细胞Kir2.1mRNA和蛋白降低分别超过60%和70%，差异有统计学意义（P＜0.01）；400μmol·L－1吉非贝齐明显上调 Kir2.1的表达，同C 7.5d组比较，Kir2.1mRNA和蛋白升高分别超过3和4倍（P＜0.01）。见表1和图1。2.3 巨噬细胞膜电位的变化 400μmol·L－1吉非贝齐显著消弱C 5d和C 7.5d组巨噬细胞表面的荧光强度（图2A和2B），使其膜电位从（1.000±0.026）分别下降至（0.833±0.046）和（0.481±0.053），差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 人巨噬细胞钾通道的表达和吉非贝齐的调节作用Tab.1 Expressions of potassium channels in human macrophages and the regulation of gemfibrozil （n＝5，±s）

＊P＜0.05compared with C 5dgroup；△P＜0.01compared with C 7.5dgroup.

Group Kv1.3 Kir2.1 mRNA Protein C 5d 1.064±0.275 0.227±0.018 1.024±0.166 0.2 mRNA Protein 04±0.018 C 7.5d 3.067±0.824＊ 0.409±0.022＊ 0.399±0.133＊ 0.042±0.008＊Gemfibrozil 1.137±0.067△ 0.143±0.023△ 1.350±0.087△ 0.202±0.033△

图1 Western blotting法检测人巨噬细胞钾通道蛋白的表达Fig.1 The expression of potassium channel protein in human macrophages detected with Western blotting

3 讨论

贝特类药物又称苯氧芳酸类药物，是指包括吉非贝齐、氯贝特、非诺贝特、苯扎贝特和环丙贝特等在内的一类调脂药物。尽管其在心血管安全性方面存在着争议，但是临床上仍被用来改善心血管危险因素［1］。目前认为：贝特类药物最主要的获益人群是以TG、小而密低密度脂蛋白胆固醇（small dense low density lipoprotein－cholesterol，sdLDL－C）升高和HDL－C降低为特征的AS血脂异常患者，尤其吉非贝齐可能具有比期待更好的心血管益处［8］，对减少冠心病患者心血管疾病剩余风险（residual risk）具有重要意义［9］。

图2 吉非贝齐作用下人巨噬细胞膜电位的变化Fig.2 Changes of membrane potential in human macrophages after treated with gemfibrozil（n＝12）

研究［3，5］表明：吉非贝齐的代谢产物 M1不仅能以剂量依赖性方式抑制LDL的氧化修饰，减弱OxLDL的细胞毒性作用，而且其还可以显著减少ApoE （－／－）鼠AS损害面积［5］。巨噬细胞通过清道夫受体（如SR－A、CD36等）无限制摄取氧化脂质导致泡沫细胞形成，是AS斑块始发与进程中的关键环节［4］。但是，吉非贝齐对巨噬细胞的功能及其分化过程有无影响迄今为止还不清楚。

Vicente等［11］发现：原代培养的鼠骨髓源巨噬细胞（bone marrow－derived macrophages，BMDMs）存在外向延迟和内向整流钾电流，分别由Kv1.3和Kir2.1携带，其在鼠BMDMs增殖及活化的过程中表现为不同的调节方式；rMargatoxin－Kv1.3阻断剂，能剂量依赖性地阻断外向钾电流而抑制鼠BMDMs增殖和活化，而Ba2＋－Kir2.1 阻断剂和 rMargatoxin 具有协同效应［10］。本课题组前期研究［6－7］证实：人单核细胞源巨噬细胞及其分化形成的泡沫细胞上均有Kv1.3和Kir2.1的表达，rMargatoxin和BaCl2均能显著减少巨噬细胞内CE的含量而抑制泡沫细胞的分化，表明Kv1.3和Kir2.1在人巨噬细胞源性泡沫细胞分化的过程中发挥着关键的调控作用。

本研究以人外周血单核细胞源性巨噬细胞为研究对象，观察吉非贝齐对Kv1.3、Kir2.1表达的影响，结果显示：在巨噬细胞发育过程中，吉非贝齐（400μmol·L－1）差别调节 Kv1.3和 Kir2.1的表达，Kv1.3mRNA和蛋白表达下降均超过60%，而Kir2.1mRNA和蛋白表达显著上调，分别超过3和4倍。VDPC的差异调节是决定特异性巨噬细胞反应的细胞内信号的关键因素。在白细胞外向钾电流有助于去极化后膜电位的恢复，而内向钾电流在超极化后发挥着关键的作用。研究［11－12］表明：Kv1.3电流设置膜电位在－50～－60mV，而Kir2.1能使膜电位下降的更低，极大增加Ca2＋内流的程度。Ca2＋内流能激活神经钙蛋白，转录因子NF－IL2A，有丝分裂原激活蛋白Ⅱ激酶和DNA合成促进因子的易位子［13－14］。因此，吉非贝齐差别调节Kv1.3和Kir2.1表达可能对巨噬细胞的增殖及活化具有重要的调控作用。

本研究中电压敏感染料膜电位标测技术结果显示：吉非贝齐显著消弱C 5d和C 7.5d组巨噬细胞表面的荧光强度，使其细胞膜电位分别下降了约17%和52%，提示除PPARα激动效应外，吉非贝齐还可能充当一种钾离子通道阻断剂对其靶细胞发挥药理学效应。

综上所述，吉非贝齐不仅可以调节血脂，而且还可能通过差别调节Kv1.3和Kir2.1表达来调控巨噬细胞的增殖、活化过程，减少泡沫细胞的形成和减轻AS血管壁炎症损伤［15］。未来的研究需要进一步阐明吉非贝齐对Kv1.3和Kir2.1电生理特征的影响以及调控巨噬细胞增殖、活化的分子／信号转导机制。

［1］Friedland SN， Leong A， Filion KB， et al. The cardiovascular effects of peroxisome proliferator－activated receptor agonists ［J］.Am J Med，2012，125 （2）：126－133.

［2］Rotllan N，Llaverías G，Julve J，et al.Differential effects of gemfibrozil and fenofibrate on reverse cholesterol transport from macrophages to feces in vivo ［J］.Biochim Biophys Acta，2011，1811 （2）：104－110.

［3］Kawamura M，Miyazaki S，Teramoto T，et al.Gemfibrozil metabolite inhibits in vitro low－density lipoprotein （LDL）oxidation and diminishes cytotoxicity induced by oxidized LDL ［J］.Metabolism，2000，49 （4）：479－485.

［4］喻红.巨噬细胞－动脉粥样硬化的治疗靶点［J］.中国动脉硬化杂志，2009，17 （7）：619－619.

［5］Calkin AC， Allen TJ， Lassila M， et al. Increased atherosclerosis following treatment with a dual PPAR agonist in the ApoE knockout mouse ［J］.Atherosclerosis，2007，195 （1）：17－22.

［6］Lei XJ，Ma AQ，Xi YT，et al.Inhibitory effects of blocking voltage－dependent potassium channel 1.3on human monocytederived macrophage differentiation into foam cells［J］.Beijing Da Xue Xue Bao，2006，38 （3）：257－261.

［7］雷新军，马爱群，席雨涛，等.阻断Kv1.3和Kir2.1抑制人巨噬细胞源性泡沫细胞分化［J］.中南大学学报：医学版，2006，31 （4）：493－498.

［8］Robinson JG.Should we use PPAR agonists to reduce cardiovascular risk？［J］.PPAR Res，2008，2008 （1）：1－13.

［9］Fruchart JC，Sacks FM，Hermans MP，et al.The residual risk reduction initiative：a call to action to reduce residual vascular risk in dyslipidaemic patient［J］.Diab Vasc Dis Res，2008，5 （4）：319－335.

［10］Vicente R，Escalada A，Coma M，et al. Differential voltage－dependent K＋channel responses during proliferation and activation in macrophages ［J］.J Biol Chem，2003，278 （47）：46307－46320.

［11］Fischer－Lougheed J，Liu JH，Espinos E，et al. Human myoblast fusion requires expression of functional inward rectifier Kir2.1channels ［J］.J Cell Biol， 2001，153 （4）：677－686.

［12］Freedman BD，Price MA，Deutsch CJ.Evidence for voltage modulation of IL－2production in mitogen－stimulated human peripheral blood lymphocytes ［J］.J Immunol，1992，149 （12）：3784－3794.

［13］Cahalan MD，Wulff H，Chandy KG.Molecular properties and physiological roles of ion channels in the immune system ［J］.J Clin Immunol，2001，21 （4）：235－252.

［14］Berridge MJ. Inositol trisphosphate and calcium signaling［J］.Nature，1993，361 （6410）：315－325.

［15］Babaev VR，Ishiguro H，Ding L，et al. Macrophage expression of peroxisome proliferator－activated receptor－alpha reduces atherosclerosis in low－density lipoprotein receptordeficient mice ［J］.Circulation，2007，116 （12）：1404－1412.

Differential regulation of Kv1.3and Kir2.1expression by gemfibrozil in human macrophages and its effects on their membrane potentials

LEI Xin－jun1，ZHANG Wei2，LIN Xian－feng3，WANG Dong－qi1，YUAN Zu－yi1，4
（1.Department of Cardiology，First Affiliated Hospital，College of Medicine，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China；2.Department of Pediatrics，First Affiliated Hospital，College of Medicine，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China；3.Krannert Institute of Cardiology and Division of Cardiology，School of Medicine，Indiana University，IN 46202，USA；4.Key Laboratory of Environment and Gene Related to Diseases，Ministry of Education，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China）

Objective To explore the development change of Kv1.3and Kir2.1channels in human macrophages and the effects of gemfibrozil on both channels’expression and their membrane potentials，which will provide electrophysiologic basis for its treating atherosclerotic diseases.Methods The obtained human monocyte－derived macrophages were randomly divided into 3groups：control 5dgroup（C 5d），control 7.5dgroup（C 7.5d）and gemfibrozil group（G）.The final concentration of gemfibrozil was 400μmo·L－1.The effect of gemfibrozil on the expressions of Kv1.3and Kir2.1channels was investigated using Real time RT－PCR and Western blotting，and its effect on membrane potentials was analyzed with the optical mapping of the membrane potential with the voltagesensitive dyes.Results Compared with C 5dgroup，the expressions of Kv1.3mRNA／protein in C 7.5dgroup were raised from （1.064±0.275）／（0.227±0.018）to （3.067±0.824）／（0.409±0.022）（P＜0.05），but the expressions of Kir2.1mRNA／protein were decreased from （1.024±0.166）／（0.204±0.018）to（0.399±0.133）／（0.042±0.008）（P＜0.05）.Compared with C 7.5dgroup，the expressions of Kv1.3mRNA／protein in gemfibrozil group were reduced to（1.137±0.067）／（0.143±0.023）（P＜0.01）；however，the expressions of Kir2.1mRNA／protein were elevated to（1.35±0.087）／（0.202±0.033）（P＜0.01）.Meanwhile，gemfibrozil significantly reduced the surface fluorescence intensity of the macrophages，and the membrane potentials in C 5dand C 7.5dgroups were decreased from （1.000±0.026）to （0.833±0.046）and （0.481±0.053），respectively （P＜0.05）.Conclusion Gemfibrozil differentially regulates the expressions of Kv1.3and Kir2.1channels in human monocytederived macrophages，and lowered their membrane potentials.

ionic channel；membrane potential；macrophage；gemfibrozil；cell differentiation

R363.21

1671－587Ⅹ（2012）05－0845－05

2012－07－06

国家自然科学基金资助课题（81170276）；陕西省科技厅自然科学基金资助课题（2009JM4006）；西安交通大学医学创新基金资助课题（JH0203111）

雷新军（1970－），男，山西省平遥县人，主治医师，医学博士，主要从事动脉粥样硬化发病机制的研究。

袁祖贻（Tel：029－85324021，E－mail：zuyiyuan＠mail.xjtu.edu.cn）