脊髓NMDA受体对心包内注射缓激肽诱发大鼠心脏－躯体运动反射的调节作用

韩 曼，孙 娜，刘晓华，杜剑青

（1.陕西中医学院生理学教研室，陕西 咸阳 712046；2.西安交通大学医学院生理学与病理生理学系，陕西 西安 710061）

脊髓NMDA受体对心包内注射缓激肽诱发大鼠心脏－躯体运动反射的调节作用

韩 曼1，2，孙 娜2，刘晓华2，杜剑青2

（1.陕西中医学院生理学教研室，陕西 咸阳 712046；2.西安交通大学医学院生理学与病理生理学系，陕西 西安 710061）

目的：观察鞘内注射N－甲基－D－天门冬氨酸（NMDA）受体激动剂NMDA及拮抗剂5－甲基－二氢－丙环庚烯－亚胺马来酸（MK801）对心包内注射缓激肽（BK）诱发大鼠心脏－躯体运动反射 （CMR）的影响，探讨脊髓水平的谷氨酸受体亚型－NMDA对心脏伤害性感受的调节作用。方法：26只雄性SD大鼠随机分为BK组（n＝8）、BK＋NMDA组（n＝6）、BK＋MK801组（n＝6）及BK＋MK801＋NMDA组（n＝6），观察大鼠心包内注射BK诱发的CMR及鞘内注射药物后CMR的变化，CMR以背斜方肌肌电（EMG）反应为观测指标。结果：心包内间隔40min重复4次注射BK诱发的CMR无明显改变（P＞0.05）；鞘内注射NMDA后EMG由基础对照的100%增加到（149.86±8.54）%，注射前后EMG比较差异有统计学意义（P＜0.05）；鞘内注射MK801后EMG由基础对照的100%减少到（96.22±2.31）%，但注射前后EMG比较差异无统计学意义（P＞0.05）；鞘内联合注射MK801和NMDA，EMG由基础对照的100%增加到（103.09±4.13）%，但注射前后EMG比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：心包内注射BK诱发的CMR具有可靠的重复性，脊髓水平的NMDA受体参与了CMR的调节。

缓激肽；心脏－躯体运动反射；N－甲基－D－天门冬氨酸；5－甲基－二氢－丙环庚烯－亚胺马来酸

心绞痛［1］是冠状动脉供血不足导致心肌急剧的、暂时性缺血与缺氧所引起的以发作性胸痛或胸部不适为主要表现的临床综合征。该病是临床常见病、多发病，约占心脏常见病的75%，被称为“人类健康的第一杀手”。因此研究心绞痛中枢调控机制具有重要的意义。动物虽无心绞痛的主观体验，可是存在与其类似的心脏伤害性感受反应。Jou等［2］研究发现：大鼠心包内注射致痛物质可诱发心脏－躯 体 运 动 反 射 （cardiosomatic motor reflex，CMR），并证明了其可作为心脏伤害性感受的一个可靠指标。本课题组在此基础上通过心包内注射辣椒素诱发CMR，并探讨了延髓头端腹内侧区和孤束核对其的调节机制［3－4］。研究［5］表明：谷氨酸（glutamate，Glu）是哺乳动物中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质，脊髓背角中间神经元也有大量的Glu，Glu及其受体参与脊髓水平伤害性信息的传递和整合。Glu受体激动剂能激活脊髓背角伤害性反应神经元，并且明显易化外周伤害性刺激诱发的神经元反应，而Glu受体拮抗剂则能抑制外周伤害性感受传入诱发的背角神经元反应和痛过敏反应。本实验通过心包内注射缓激肽（bradykinin，BK）诱发 CMR，以背斜方肌的肌电（electromyogram，EMG）反应为观测指标，探讨脊髓水平的Glu受体亚型N－甲基－D－天门冬氨酸（N－methy1－D－aspartate，NMDA）对CMR的调节作用。

1 材料与方法

1.1 仪器和药品 BL－420生物信号采集与分析系统及压力换能器（成都泰盟生物科技有限公司）；蠕动泵（BT100－2J，保定兰格恒流泵有限责任公司）；小动物呼吸机（DW3000－B型，淮北正华生物仪器设备有限公司）。戊巴比妥钠、缓激肽、NMDA及MK801（购于美国Sigma公司），药物均溶解于生理盐水中，配制成所需浓度（戊巴比妥钠20和5g·L－1，缓 激 肽 1×10－3g·L－1，NMDA 1.47×10－4g·L－1，MK801 0.68g·L－1），最后pH调至7.2～7.4。

1.2 实验动物分组及处理 26只健康雄性SD大鼠，体质量260～330g，随机分为4组：BK组（n＝8）、BK＋NMDA组（n＝6）、BK＋MK801组（n＝6）和BK＋MK801＋NMDA（n＝6）。2%戊巴比妥钠（45～55mg·kg－1）静脉注射将实验动物麻醉，暴露左侧背斜方肌，记录背斜方肌EMG。气管插管以便对动物行人工呼吸（呼吸频率60～70min－1，潮气量5.0～6.0mL），左侧颈静脉插管从而在整个实验过程中维持戊巴比妥钠的麻醉（10～15mg·kg－1·h－1），右侧颈动脉插管监测动脉血压。以动脉血压和瞳孔直径判断实验动物麻醉深度。直肠温度计监测大鼠体温，通过温控仪维持大鼠体温在（37.0±0.5）℃。① 心包插管术：将左侧上胸部第1～3肋软骨切断，暴露胸腺。小心分离胸腺2片小叶，暴露心包膜。用玻璃针的尖端（直径0.5mm）在心包膜上扎开1个小孔，将1个内径0.020cm、外径0.037cm、长12～14cm远端有数个小洞的硅胶管顺胸腺2叶之间的间隙插入心包约2cm，缝合各层胸壁组织，以固定心包插管。心包内每次可注入和抽出的液体量约为0.2mL。② 鞘内置管术及鞘内药物注射：动物仰卧位固定在温控仪上，于两耳间连线中点处逐层打开皮肤、肌肉，暴露枕骨大孔，用精细眼科手术剪小心剪开硬脊膜，看到清亮的脑脊液流出，行鞘内置管术。一段充满生理盐水长约10cm PE10导管从枕骨大孔处向脊髓蛛网膜下腔插入长度为3.5～4.0cm置于T3～5脊髓节段。心包内注射BK前15min，取10μL的NMDA（1.47×10－4g·L－1）或 MK801（0.68g·L－1）通过PE10导管向 T3～5脊髓节段缓慢注入或预先鞘内注射10μL MK801 10min后再注射10μL NMDA。每次实验结束后，经该导管注入10μL 2%膀胺天蓝以标记药物的扩散范围，统计注射位置在T3～5脊髓节段的实验数据。③心包给药对心脏重复伤害性刺激：心包内注射BK 0.2mL（1×10－3g·L－1），记录EMG活动60s后回抽，0.2mL温热无菌生理盐水连续冲洗心包5次，去除心包内残留的BK，间隔40min重复心包刺激。每次心包注入BK的同时记录EMG，如此反复4次心包注射。

1.3 EMG的测定 同芯电极以30°的角度插入左侧背斜方肌，记录其EMG信号，根据肌肉大小调节电极插入深度，一般为1.5～1.7mm。

1.4 大鼠肌电活动的记录 大鼠肌电活动采用BL－420软件进行记录，所记录的EMG幅度如果超出基线活动10%，就可认为是由BK诱发的CMR。每次BK诱发EMG反应总放电单位数（total number of motor unit discharges，TMUD）通过BL－420分析软件直接统计得出。由于不同大鼠BK诱发的TMUD有所不同，为了消除个体之间的差异，每只大鼠第1次心包内注射BK所诱发的TMUD被标化为100%，作为基础对照；其后EMG反应的TMUD均以第1次心包内注射BK所诱发的TMUD为分母进行标化，得出百分数，即被标化的TMUD，也就是EMG的变化率。

1.5 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。各处理因素引起大鼠心包内注射BK诱发CMR的背斜方肌EMG的变化率以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 心包内注射BK所诱发的CMR 每只大鼠心包内重复4次注射BK，每次间隔40min。结果显示：每只大鼠心脏重复4次BK伤害性刺激，不会引起EMG明显变化，即大鼠没有产生耐受现象。第2～4次心包内注射BK诱发EMG分别为第1次（基础对照为100%）的（98.65±1.55）%、（97.21±1.32）%、（97.70±1.98）%（n＝8，P＞0.05）。原始肌电反应见图1。

图1 心包注射BK诱发的EMG反应Fig.1 EMG response induced by intrapericardial injection of BK

2.2 鞘内注射 NMDA、MK801及联合注射MK801和NMDA后CMR的变化 BK＋NMDA组大鼠鞘内注射10μL NMDA后记录到的EMG增加 到 基 础 对 照 的 （149.86±8.54）% （P＜0.05）；BK＋MK801组大鼠鞘内注射10μL MK801后记录到的EMG降低到基础对照的（96.22±2.31）%，但前后比较差异无统计学意义（P＞0.05）；BK＋MK801＋NMDA组大鼠联合注射MK801和NMDA后记录到的EMG增加到基础对照的 （103.09±4.13）%，但前后比较差异无统计学意义 （P＞0.05）。原始肌电反应见图2。

图2 鞘内注射NMDA、MK801及NMDA＋MK801前后EMG的变化Fig.2 Changes of EMG responses before and after intrathecal injection of NMDA，MK801and NMDA＋MK801

3 讨 论

以往的研究［5］证明：机体组织损伤或炎症时，受伤细胞会释放出大量内源性致痛物质，包括BK、腺苷、钾离子、5－羟色胺、组织胺、前列腺素等。心绞痛发作时损伤心肌组织也会释放大量的化学物质，这些物质具有单独或协同致痛作用。BK被认为是最重要的内源性致痛因子，其可通过激活心脏交感神经中的A和C类纤维末梢引起疼痛。目前BK作为一种致痛化学物质也被用来诱发心绞痛和 CMR［2，6－8］。本实验结果显示：向大鼠心包内注射BK可引起背斜方肌产生显著的EMG反应，说明心包内注射BK可引起大鼠产生心脏伤害性感受，即CMR。同一只大鼠心包内重复4次，每次间隔40min注射BK所诱发的EMG活动无明显差异，说明心包内注射BK所诱发的CMR具有可靠的重复性，证明心包内重复4次注射BK诱发EMG活动的稳定性，从而排除了因反复心包内注射BK可能产生的耐受现象，确保鞘内注射药物后对CMR调节作用的准确性。

Glu受体分为两大类：离子型受体和代谢型受体，其中离子型受体又分为NMDA受体和非NMDA受体。研究［9］发现：人和大鼠脊髓后角NMDA受体密度较高，特别是后角Ⅰ－Ⅱ层。正常大鼠鞘内注射Glu可诱发痛反应行为和脊髓后角cFos的表达，而鞘内注射NMDA受体拮抗剂可阻断上述效应［10］。本实验鞘内注射NMDA受体特异性的激动剂NMDA后可明显增强心包内注射BK诱发的CMR，提示脊髓水平NMDA受体的激活易化了大鼠心脏伤害性感受反应。相关研究［11－12］表明：NMDA受体被激活后，活化了脊髓背角的广动力神经元内的蛋白激酶，继而灭活了其下游的γ－氨基丁酸和甘氨酸能受体，从而导致抑制性作用的降低，结果增强了广动力这一类神经元的兴奋性和反应性。同时，初级传入中枢突上的突触前NMDA受体的激活可进一步促进疼痛相关物质的释放，使脊髓背角神经元敏感化。

MK801为非竞争性NMDA受体拮抗剂，可阻断NMDA受体耦联的Ca2＋通道激活，使Ca2＋内流减少，从而使NMDA受体的药理效应减弱，大剂量NMDA对其无翻转作用，故MK801对NMDA受体的阻断作用是非竞争性的。在本实验结果中，大鼠鞘内注射MK801对心包内注射BK引起的CMR无影响，但是却可以显著地抑制鞘内注射外源性NMDA引起的CMR超敏现象，这可能是心包内注射BK诱发心脏伤害性感受时通过伤害性初级传入纤维中枢突释放兴奋性氨基酸 （如Glu）的数量少，不能大量激活脊髓背角NMDA受体，因而鞘内注射MK801对CMR无影响。而鞘内注射大剂量的外源性的NMDA后可大量激活脊髓背角NMDA受体，通过上述作用，提高脊髓背角广动力神经元的兴奋性及脊髓背角神经元的敏感性，故鞘内注NMDA后可明显易化CMR。预先鞘内注射MK801后再注射NMDA，由于非竞争性阻断了脊髓背角NMDA受体上NMDA的结合位点，NMDA受体不能被NMDA激活，其对CMR的易化作用就不能体现出来。

本实验结果表明：NMDA受体参与了心脏伤害性感受反应，即CMR，但具体是NMDA受体哪几种亚型参与了心脏伤害性信息在脊髓的传递，尚需进一步研究证实。

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Modulation of NMDA receptor to rat cardiacsomatic motor reflex induced by intrapericardial bradykinin in spinal cord

HAN Man1，2，SUN Na2，LIU Xiao－hua2，DU Jian－qing2
（1.Department of Physiology，Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China；2.Department of Physiology and Pathophysiology，College of Medicine，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China）

Objective To observe the effects of the intrathecal injection of N－methyl－D－aspartate（NMDA）receptor agonist NMDA and antagonist MK801on the cardiacsomatic motor reflex （CMR）induced by intrapericardial bradykinin（BK），and explore the role of Glu receptor NMDA subunit in nociceptive information transmission of the heart in the spinal cord.Methods 26male SD rats were randomly divided into BK group（n＝8），BK ＋ NMDA group（n＝6），BK ＋ MK801group（n＝6），and BK ＋ MK801＋ NMDA group（n＝6）.CMR was induced by intrapericardial BK，and the effects of intrathecal injection of drug in various groups on CMR were observed.The changes of CMR were monitored via electromyogram （EMG）responses of dorsal spinotrapezius muscle to intrapericardial BK.Results There were no significant differences among EMG induced by intrapericardial BK，four times at 40min intervals.Compared with control，the EMG was increased from 100%of control to（149.86±8.54）%by intrathecal injection of NMDA，there was significant difference of EMG between before and after intrathecal injection of NMDA （P＜0.05）.However，the EMG was decreased from 100%of control to（96.22±2.31）%by intrathecal injection of MK801，there was no statistically significant difference（P＞0.05）.The EMG was increased from 100%of control to （103.09±4.13）%by intrathecal combinative injection of MK801and NMDA，there was no significant difference of EMG between before and after intrathecal combined injection of MK801and NMDA（P＞0.05）.Conclusion CMR induced by intrapericardial BK has reliable repeatability and the spinal cord level of NMDA receptor involves in the modulation of CMR.

bradykinin；cardiacsomatic motor reflex；N－methy1－D－aspartate；MK801

R338.22

A

1671－587Ⅹ（2012）05－0832－04

2012－03－28

国家自然科学基金资助课题 （31171068）

韩 曼 （1976－），女，陕西省礼泉县人，讲师，医学硕士，主要从事心血管生理基础方面的研究。

杜剑青 （Tel：029－82657490－802，E－mail：dujianq＠mail.xjtu.edu.cn）