鹿油的超临界二氧化碳萃取工艺及分析

刘俊渤，王 丽，胡耀辉，朱玉婷，于寒松

(1吉林农业大学资源与环境学院，吉林长春130118;2吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118)

鹿是一种珍贵的、具有药用作用的特种经济动物.随着我国鹿业市场的拓展和逐步成熟，每年都有大量鹿油得不到充分利用.鹿油富含饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸等多种功能性营养物质，其作为药物使用早在《唐本草》与《中国医学大辞典》就有记载.1999年朱秋劲等［1］对鹿油脂肪酸成分进行了分析.目前关于鹿油的提取、精炼及深加工技术等方面的相关研究很少，因此鹿油的研究前景广阔.

目前动物油提取的方法有直接熬制法、蒸煮法、溶剂法、酶解法、超临界流体萃取法等.随着人们对绿色产品的不断追求，超临界流体萃取技术越来越受到研究学者的关注［2］.超临界流体尤其是超临界CO2萃取技术，具有工艺简单、操作方便、无污染、低温操作及抗氧化灭菌［3-6］等特点，它克服了传统提取法易氧化酸败、溶剂残留等问题，尤其对热敏性及易挥发生物功能性物质具有良好的保护作用，从而保证了鹿油的品质与功能，这对鹿油在医药保健品、化妆品、环保［7-8］、食品［9］、化工［10］等领域中的应用有着重要意义.但是超临界CO2萃取也存在时间长、产率低等问题，因此，本研究以鹿肉为原料，采用正交试验，通过控制萃取温度、压力、时间因素，探讨了超临界CO2萃取鹿油的最佳工艺，同时对超临界萃取的鹿油进行脂肪酸组成及基本理化性质的分析，旨在为鹿油生产应用提供理论支持，同时也为鹿油开发提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

梅花鹿肉，由吉林农业大学梅花鹿养殖场提供.

CO2(φ＞99.5%)，长春市氧气厂;乙醇(φ＞99.7%)、乙醚(φ＞99.5%)、碘化钾，国药集团化学试剂有限公司;氢氧化钾、硫代硫酸钠，天津市化学试剂三厂;冰醋酸(φ＞99.5%)、盐酸、硫酸、四氯化碳，北京化工厂.

Spe-ed Sfe-2/4超临界CO2萃取仪，美国Applied Separations;DZF-6020真空干燥箱，上海-恒科学仪器有限公司;KQ5200DE超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;GC-MS气相色谱-质谱联用仪(5975)，Agilent公司.

1.2 方法

1.2.1 原料预处理 将新鲜的鹿肉清洗除杂、冷冻粉碎，在相对真空度0.09 MPa、温度90℃条件下干燥2 min后降温至40～50℃下干燥，使鹿肉含水质量分数为0.06% ～0.08%，干燥后在40 kHz、40℃下超声20 min，备用.

1.2.2 工艺流程与操作流程 鹿肉→除杂粉碎→干燥脱水→超声→装料→萃取→鹿油.

称取15.00 g预处理后的鹿肉原料装入反应釜，加盖拧紧，装入反应器中，升温、加压，调CO2流量至400 mL/min，萃取一定时间后收集鹿油.鹿油萃取率计算公式:鹿油萃取率 =鹿油质量/鹿肉质量 ×100%.

1.2.3 单因素试验 萃取压力的优化:称取15.00 g预处理后的鹿肉原料，以鹿油萃取率为评价指标，萃取温度40℃、萃取时间90 min，萃取压力分别为15、20、25、30、35、40 和 45 MPa，采用超临界 CO2萃取鹿油，研究萃取压力对鹿油萃取率的影响.

萃取温度的优化:称取15.00 g预处理后的鹿肉原料，以鹿油萃取率为评价指标，萃取时间90 min，萃取压力35 MPa，萃取温度分别为30、35、40、45、50、55和60℃，采用超临界CO2萃取鹿油，研究萃取温度对鹿油萃取率的影响.

萃取时间的优化:称取15.00 g预处理后的鹿肉原料，以鹿油萃取率为评价指标，萃取温度40℃，萃取压力35 MPa，萃取时间分别为30、60、90、120、150、180和210 min，采用超临界CO2萃取鹿油，研究萃取时间对鹿油萃取率的影响.

1.2.4 正交试验 影响超临界CO2萃取的因素很多［11-15］，其中，萃取压力(p萃取)、萃取温度(θ萃取)和萃取时间(t萃取)是影响超临界流体萃取率的重要因素.在单因素试验基础上筛选出萃取压力、萃取温度、萃取时间的影响水平，进行L9(34)试验设计(表1)，以萃取率为指标，进行正交试验.进料量15.00 g，CO2流量400 mL/min.

表1 L9(34)正交试验因素水平表Tab.1 L9(34)Orthogonal experiment factors and levels

1.2.5 鹿油理化指标测定［16］肉眼观察色泽;参考GB/T 5532—85测定碘价;参考 GB/T 5534—85测定皂化值;参照GB/T 5530—85测定酸价.

1.2.6 鹿油脂肪酸成分分析 将最优萃取条件下得到的鹿油样品采用GC-MS气相色谱-质谱联用仪进行脂肪酸成分分析.气相色谱-质谱条件:玻璃毛细管柱(60.00 mm×0.25 mm×0.25 μm);程序升温条件:起始温度100℃，然后以10℃/min的速度升至230℃，恒温40 min;进样口温度:250℃;载气:高纯氦气，流速为1 mL/min，分流体积比10∶1;接口温度:250℃;电离方式:EI;电子能量:70 eV，离子温度230℃，四极杆温度150℃;调谐方式:标准调谐;质量扫描方式:SCAN;溶剂延迟:3 min;扫描质量范围:10～550 amu;电子倍增器电压:1.635 V.

1.3 鹿油样品分析

准确称取鹿油样品0.100 0～0.200 0 g，加异辛烷溶解定容至10.0 mL，混匀，用微量注射器吸取50 μL于10 mL刻度试管中，加入0.4 mol/L KOH-甲醇溶液2.0 mL，置漩涡混合器2 min，室温放置10 min.再加入异辛烷1.95 mL，再置旋涡混合器2 min，加80 g/L NaCl溶液至10 mL刻度，以2 000 r/min离心10 min，吸出上清液(异辛烷层)于2 mL小试管中，在上述GC/MS分析条件下，进样1μL，以峰保留时间及谱库检索定性，与相应标准峰面积比较定量.

2 结果与分析

2.1 超临界萃取条件单因素试验

2.1.1 萃取压力对鹿油萃取率的影响 由图1a可

知，随着萃取压力升高，鹿油提取率也随着逐步增大.当萃取压力从15 MPa升到35 MPa时，鹿油提取率增大显著;当萃取压力超过35 MPa后，鹿油萃取率的增加变得缓慢，但仍呈现持续增加的状态.压力对萃取率的影响比较显著，压力增大可增加CO2的密度，使分子间平均自由程减小，有利于扩散与渗透，进而提高了超临界CO2对鹿油的萃取率.但当压力增大到一定程度后，由于压力改变对溶质的溶解度影响很小，因此萃取率无明显提高，且从能源、经济等综合因素考虑，鹿油萃取压力以30～40 MPa为宜.

2.1.2 萃取温度对鹿油萃取率的影响 由图1b可知，在萃取压力35 MPa，萃取时间90 min条件下，随着温度的升高，鹿油萃取率增大明显，当萃取温度超过40℃后，其萃取率增大缓慢，而当温度超过50℃后，鹿油萃取率反而出现下降趋势.这是因为温度对鹿油提取率的影响十分复杂，在一定的压力下，升高温度，可降低超临界CO2流体的运动黏度，提高系统中流体分子的热运动速率，增大分子的扩散能力，从而使溶质的溶解度增加，有利于鹿油的浸出.但升高温度的同时，超临界CO2的密度降低，不利于溶质在流体中溶解，反而使鹿油萃取率降低，并且温度过高，仪器设备的使用寿命也会受到影响，综合因素考虑，鹿油萃取温度以40～50℃为宜.

2.1.3 萃取时间对鹿油萃取率的影响 萃取时间对超临界CO2萃取鹿油有显著影响.超临界萃取属于扩散过程，需要一定时间才能萃取充分.萃取初期，由于溶剂的扩散速率缓慢，萃取率较低，随着时间的延长，溶剂扩散能力增强，萃取率增大.从图1c可知，在萃取温度40℃、萃取压力35 MPa条件下，萃取时间越长鹿油萃取率越高.在30～120 min时间内，鹿油萃取率随着萃取时间的增加而显著提高，但120 min后，随着萃取时间的增加鹿油萃取率基本趋于平缓，因此鹿油萃取时间以120～180 min为宜.

图1 萃取条件对鹿油得率的影响Fig.1 Effects of extraction conditions on the yield of deer oil

2.2 正交试验结果

在单因素试验的基础上，采用三因素三水平的的正交设计方案，在9种不同工艺条件下萃取鹿油，分别测定其萃取率，结果见表2.表2的极差分析结果表明，超临界萃取3个因素对鹿油萃取率的影响顺序为:萃取温度＞萃取压力＞萃取时间，鹿油的最佳萃取方案为A2B3C2，即最佳萃取工艺条件组合为萃取温度45℃，萃取压力40 MPa，萃取时间150 min.

2.3 最佳萃取条件验证

在上述最佳条件下(萃取温度45℃、萃取压力40 MPa、萃取时间150 min)进行3次重复试验，其鹿油萃取率分别为32.22%、32.28%和32.25%，由萃取率可看出，最佳萃取工艺条件具有较好的重复性，鹿油萃取率较高，说明该工艺条件是合理的、可靠的.

表2 正交试验结果Tab.2 Orthogonal experiment results

2.4 鹿油理化指标分析

对在萃取温度45℃、萃取压力40 MPa、萃取时间150 min条件下萃取所得鹿油进行理化性质分析，结果表明，超临界萃取的鹿油呈纯白色固体絮状，质量浓度为0.907 g/mL，碘值为37.55，酸价为1.08 mg/g，皂化值为178.5 mmol/g.碘值、酸价和皂化值都是检测油脂品质的基本理化指标，碘值是衡量鹿油不饱和酸含量的指标，酸值是衡量鹿油游离脂肪酸含量的指标，皂化值则是衡量鹿油脂肪酸相对分子质量大小的指标.超临界萃取的鹿油酸价为1.08 mg/g，说明超临界CO2萃取的鹿油游离脂肪酸较少，酸败程度较低，具有良好的应用前景.

2.5 鹿油脂肪酸组成含量检测分析

将超临界CO2最佳萃取工艺条件下所得鹿油直接甲酯化，得鹿油脂肪酸甲酯色谱图(图2).采用面积归一法计算其质量分数，结果见表3.由表3可知，鹿油含有多种饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸质量分数达到41.94%，其中油酸(十八碳烯酸)和亚油酸(十八碳二烯酸)质量分数相对较高，油酸具有极佳的渗透性，不仅能够降低胆固醇、防止大脑衰弱，同时能够保护皮肤，防止皮肤损伤和衰老，保持皮肤光滑细腻，也可作润滑剂，减少制品变形，增加表面光洁度，在化妆品和塑料行业中广泛应用;亚油酸具有滋润护肤的作用，还具有抗癌作用，同时能够提高人体免疫力，减少人体脂肪沉积，有良好的减肥功效.饱和脂肪酸中以棕榈酸(十六烷酸)和硬脂酸(十八烷酸)含量最高，棕榈酸是制作肥皂的良好原料之一，硬脂酸和棕榈酸都可以用来做乳化剂，使得到的膏体稳定洁白.因此，鹿油将在医药保健品、化妆品等行业中具有广阔的应用前景.

图2 鹿油脂肪酸甲酯色谱图Fig.2 Fatty acid methyl esters chromatogram of deer oil

表3 鹿油中各脂肪酸成分与含量Tab.3 Chemical compositions and contents of fatty acids in deer oil

3 结论

通过单因素试验与正交试验，确定了超临界CO2萃取鹿油的最佳工艺条件为萃取温度45℃、萃取压力40 MPa、萃取时间150 min.萃取的鹿油为纯白色，无杂质，富含多种饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，其碘值为37.55，酸价为1.08 mg/g，皂化值为178.5 mmol/g.本研究不仅为超临界CO2萃取技术在动物油脂提取中的进一步应用提供了可靠依据，也为鹿油的深层次开发奠定了基础.

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