黄芩体外抑菌作用的初步研究

王秋菊 杨建省 重庆市云阳县畜牧兽医局 404500

鸭疫里默氏杆菌病 （Riemerrela anatipestifer，RA）又称鸭传染性浆膜炎 （infectious serositis in duckings），是目前危害养鸭业最重要的传染病之一[1]。目前国际上已经确定的血清型有21型，在美国以Ⅰ、Ⅱ、ⅹ为主，在对我国京、沪、川等地区的鸭疫里默氏杆菌的研究中发现，我国以Ⅰ和Ⅱ型为主[2]。鸭疫里默氏杆菌是主要侵害家鸭、火鸡和鸟类的一种接触性传染病，主要侵害2-7周龄的雏鸭，呈急性或慢性败血症。临床上主要表现为眼和鼻分泌物增多、喘气、咳嗽、下痢、共济失调和头颈震颤，少数慢性病例出现头颈歪斜等症状。

目前药物治疗仍然是控制鸭疫里默氏杆菌病的首选方法，由于抗生素的滥用，使细菌菌株的耐药性增强，很多药物的疗效降低。中草药是天然性药物，无毒、低残留、不易产生抗药性，因此引起了广泛的关注。有研究表明，100%黄芩浸出液滤纸片对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、绿脓杆菌、乙型链球菌都有明显的抑菌作用[3]。目前对RA感染治疗的报道很多，但是对中药治疗的报道较少。为此，本文研究了黄芩对RA的生长及抗生素耐药性的逆转作用，探讨黄芩的体外抗菌作用机理，为实际生产应用提供理论指导。

1 实验材料和方法

1.1 主要仪器设备

高速台式离心机（TGL-16B）：上海安亭科学仪器厂；

恒温培养箱（GHX-90808-1）：上海福玛实验设备有限公司；

电子分析天平（AR1140/C）：上海奥豪斯公司；

旋转蒸发仪（S2-93）：上海亚荣生化仪器厂；

超净工作台（SW-GJ-ZFD）：苏州净化设备有限公司。

1.2 主要试剂

黄芩、抗生素纸药片、蛋白胨（Tryptone）、酵母粉（Yeast Extract）、琼脂。

1.3 主要的菌株

鸭疫里默氏杆菌菌株：西南大学荣昌校区中兽医实验室保存。

1.4 药液的制备

将黄芩粉碎，称重后加入8倍蒸馏水浸泡后煎煮，30min/次，煎煮2次，合并两次的煎煮液，离心去除掉液体里的药物残渣，用旋转蒸发仪在75℃下蒸馏浓缩，浓缩后每毫升药液含1g生药。药液分装，高压灭菌20min，置于4℃冰箱中备用。

1.5 黄芩对RA最低抑菌浓度（MIC）的测定

（1）菌液的制备

取RA菌种划线接种于普通琼脂平板，37℃过夜培养，革兰氏染色镜检合格后，挑去单个菌落接种于5mL肉汤培养基，于37℃震荡培养至对数生长期，用灭菌的肉汤培养基稀释调整浓度在1×103CFU/mL。

(2)最低抑菌浓度的测定

采用5倍稀释法测定。取8支灭菌的试管，无菌浓度下分别加入浓度为1×103CFU/mL的菌液4mL/支，分别编号 1，2，3，4，5，6，7，8；取 1mL 药液加入第1号灭菌的试管，混匀，然后吸取1mL加入到第2支试管，如此依次稀释到第7支试管，第8支试管不加药液作为对照；另取一支试管做不加菌液只有药物的对照。37℃下震荡培养过夜，观察细菌生长情况，并测定培养前与培养后OD600值，以与对照组无显著差异管的最高稀释度作为黄芩对RA的MIC。

1.6 黄芩对RA耐药性的逆转作用

按1：100的比例将一定量的RA纯培养物接种于5mL浓度为0.3MIC的普通肉汤培养基中，37℃、170rpm/min下震荡培养过夜，记为第1代。再将第1代培养物按1：100的比例接种于5 mL浓度为0.3MIC的普通肉汤培养基中，37℃、180rpm/min下震荡培养过夜，记为第2代。按照此方法连续培养至20代，并注意观察细菌的生长情况。取第20代培养物，采用1.5方法测定黄芩的最低抑菌浓度，比较与原代之间的差别，同时设立不含黄芩药液的空白对照和pH值与试验组一致的阴性对照。

1.7 黄芩对RA抗生素耐受性的逆转作用

取1.6RA原代和第20代纯培养物，采用药敏纸片法，测定对四环素 （Tetracucline）、卡那霉素（Kalamycin）、 强力霉素 （Doxycycline）、 新霉素（Neomycin）、 阿 莫西林 （Amoxicillin）、 链 霉 素（Streptomycin）、环丙沙星（Ciprofloxacin）和氟哌酸（Norfloxacin）的敏感性，测定抑菌圈大小，比较两代培养物之间的差异。

表1：黄芩对RA菌株的最低抑菌浓度

2 实验结果与分析

2.1 黄芩对RA菌株最低抑菌浓度的测定

用5倍稀释法测定梯度稀释，测定黄芩对RA菌株的最低抑菌浓度。菌液初始浓度为1×103CFU/mL，以与对照组无明显差异管的最高稀释度作为黄芩对RA的MIC。试验结果显示,黄芩对RA菌株的MIC为1.6mg/mL,见表1。

2.2 黄芩对RA的耐药性诱导作用

将RA在含有0.3MIC药物浓度的培养基中连续传代20代，测定黄芩对RA第20代的MIC，结果见表2。实验结果表明：黄芩浓度为1.6mg/mL时，RA生长情况与空白对照组的差异很小，即黄芩对第20代RA的MIC为1.6mg/mL。

表2：黄芩对RA菌株耐药性的诱导作用

2.3 黄芩对RA抗生素耐受性的逆转作用

将RA在含有0.3MIC药物浓度的培养基中连续传代20代，采用药敏制片法分别测定原代和第20代纯培养物对抗生素的敏感性，经游标卡尺测定抑菌圈的大小，两代次的比较结果见表3。研究结果显示：RA对四环素、卡那霉素、环丙沙星的敏感性并未发生显著的变化，对强力霉素、阿莫西林、链霉素、新霉素、氟哌酸的敏感性发生了显著性的变化。研究结果表明，经过传代后的RA对抗菌药物的敏感性增强。

3 分析与讨论

3.1 黄芩对RA菌株的耐药性诱导作用

研究发现，RA在含有低浓度黄芩的培养基中连续传代后，MIC无变化，说明RA对黄芩不容易产生耐药性。

3.2 黄芩对RA抗生素耐受性逆转作用

本研究发现，将RA在含有0.3MIC药物浓度的培养基中连续传代20代，采用药敏制片法分别测定原代和第20代纯培养物对抗生素的敏感性，结果显示：RA对四环素、卡那霉素、环丙沙星的敏感性并未发生显著的变化，对强力霉素、阿莫西林、链霉素、新霉素、氟哌酸的敏感性发生了显著性的变化。研究结果表明，经过传代后的RA对抗菌药物的敏感性增强。病原菌对抗生素产生耐受性主要是通过基因水平或者是蛋白质水平实现的，而重要对病原菌抗生素耐受性的逆转作用也就是通过这两个水平实现的，且对不同药物耐受性的逆转作用强度不同。重要对病原菌抗生素耐受性产生逆转作用的可能机制主要包括：

表3：黄芩对RA菌株抗生素耐受性的逆转作用

（1）破坏RA菌体细胞的荚膜多糖成分，药物与细菌发生直接接触，从而使菌体细胞对黄芩的敏感性增强；（2）一直细菌DNA、RNA、蛋白质的生物合成或者阻断菌体细胞的讯号通路，影响RA菌体细胞的正常生理活动。本研究中RA经连续传代后对部分抗生素的敏感性增强，其确切的原因有待进一步的深入研究。

[1]卡尔尼克BW（高福,刘文军主译）.禽病学（第九版）[M].北京：北京农业大学出版社,1991.

[2]陆承平.兽医微生物学[M].北京:中国农业出版社.

[3]刘云波,郭立华,邱世翠,等.黄芩体外抑菌作用研究[J],时珍国医国药.2002,13(10):596.