江西柑橘主产区柑橘衰退病毒分离株组群分析

易 龙， 赖晓桦， 卢占军1，， 钟八莲

（1.赣南师范学院生命与环境科学学院，赣州 341000；2.江西省脐橙工程技术研究中心，赣州 341000）

柑橘衰退病是由柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）引起的柑橘上极具经济重要性的病害之一，严重影响着柑橘的产量和品质，对柑橘生产造成了严重的危害。CTV主要通过蚜虫和带病接穗进行传播，目前已经毁灭了超过1亿株的柑橘，并仍然严重威胁着世界上以酸橙作砧木的柑橘产区和对茎陷点型CTV敏感的柚类、葡萄柚和某些甜橙的安全［1]。

由于CTV在田间通过蚜虫传播，国外的防治经验表明，在CTV强毒株和有效传媒橘蚜存在的种植区域，弱毒株交叉保护是最有效的防治措施［2－3]，而对其分离株的分析是应用该技术的基础［4]。江西赣南凭借其得天独厚的适宜脐橙生长的环境条件，已成为种植面积世界第一的脐橙主产区［5]。在前期调查中发现赣南脐橙上CTV感染率达44.9%［6]，给生产带来了严重的威胁。目前针对江西赣南脐橙产区柑橘衰退病毒分离株的构成情况尚缺乏全面调查，因此有必要对产区CTV分离株进行致病性鉴定，明确其组群构成情况，寻找潜在的弱毒分离株，为今后江西柑橘衰退病的深入研究以及筛选弱毒株进行交叉保护防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试样品

分别采自江西信丰、安远、寻乌、龙南、崇义等柑橘主产区，经直接组织点免疫法（DTBIA）［7]检测呈阳性的209份样品作为供试样品。

1.2 样品总核酸提取

按照周常勇等［8]的方法提取样品总核酸。

1.3 外壳蛋白（CP）基因的扩增

参照Gillings等［9]的方法，由上海生工生物工程公司合成CTV外壳蛋白（CP）基因的特异性引物CP1（5′－ATGGACGACGAAACAAAG－3′）、CP3（5′－TCA－ACGTGTGTTGAATTT－3′），在Bio－Rad公司生产的 PTC－200型基因扩增仪进行反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）。PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，用GoldView I染色后在Gel DocTMXR型凝胶成像系统上观测。

1.4 限制性片段长度多态性（RFLP）分析

将PCR产物与限制性内切酶HinfⅠ（TaKaRa产品）反应体系相混合，37℃酶切1h，用3%超纯琼脂糖凝胶电泳后检测酶切图谱［9]。

2 结果与分析

2.1 CTV CP基因的扩增

对样品抽提的总核酸用CTV CP基因特异性引物进行RT－PCR扩增，209份样品及阳性对照均能扩增出一个大小约672bp的DNA条带（图1），与已知CTV的CP基因大小相一致，阴性对照和水对照均不能扩增出该产物。

图1 江西柑橘产区部分柑橘样品CTV的RT－PCR扩增结果

2.2 CP／HinfⅠRFLP分析

根据Gillings等［9]的CTVCP／HinfⅠRFLP组群划分标准，本试验中209份样品的CP／HinfⅠ酶切结果中182份样品表现出单一CP／HinfⅠRFLP谱型，占鉴定样品总数的87.1%，表明在本次试验中检测的江西柑橘样品以CTV单一组群感染为主，主要分属于CP／HinfⅠRFLP第3和第1组群（图2）。

图2 江西柑橘产区部分柑橘样品CTV的CP／Hinf I RFLP酶切图谱

进一步分析表明，在209份样品中单一RFLP组群3、1分别占样品总数的55.5%、26.8%，说明江西柑橘CTV分离株主要由CP／HinfⅠRFLP第3和第1组群构成；同时有27个样品含有多个RFLP组群，占样品总数的12.9%，表明田间存在不同CTV分离株混合侵染的现象，其中以组群1和3混合发生为主，所有样品中未检出RFLP第2和第7组群的CTV分离株（表1）。检测样品中有1个分离株为第4组群，5个分离株为第5组群，初步判断为潜在的弱毒株，有待进一步进行验证。

表1 江西柑橘产区柑橘衰退病毒CP／HinfⅠRFLP组群构成情况

3 讨论

CTV为一种正义单链RNA病毒，具有较高的变异几率，常由多个不同的分离株所组成［10]，给病害的鉴定和防治带来了一定的难度，在生产上往往需要准确、快速的方法对CTV的各个分离株进行鉴定和区别。CTV被分成具有不同生物学特性的7个CP／HinfⅠRFLP组群，其中第4组群和第5组群的分离株在指示植物上呈弱反应，从中可以筛选具有潜在交叉保护作用的弱毒株；而其余组群中的分离株在指示植物表现出强致病性［9]。据此，国内外广泛运用CP／HinfⅠRFLP技术对CTV的CP基因进行限制性酶切，来快速准确地对CTV分离株进行致病性鉴定［9，11－13]。

本研究结果表明在江西柑橘主产区CTV的CP／HinfⅠRFLP组群构成以第3、1组群为主，其余组群发生较少，研究结果与Xu等［11]分析我国福建、重庆甜橙产区113个CTV分离株主要以CP／HinfⅠRFLP第3和1组群构成结果相类似，但其研究结果田间以混合组群发生为主，而本研究中江西柑橘主产区CTV以单一组群构成为主，可能是江西赣南大部分柑橘园中的树龄不长，CTV感染的时间短，变异较少，加上果园中传媒昆虫少等原因而导致混合感染发生率低，存在差异的具体原因还有待进一步分析。另外本研究中分析的样品RFLP组群图谱总体符合Gillings［9]建立的CTV组群划分标准，在今后江西柑橘产区田间大量样品CTV分离株的快速鉴定中可运用此技术。

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