林可霉素A分子印迹聚合物微球的制备及性能

蒋兴娜,李卫朋,张佑红,朱雄伟,谌 颉,苏腾甲

(武汉工程大学化工与制药学院，绿色化工过程省部共建教育部重点实验室，湖北 武汉 430074)

0 引 言

林可霉素[1]是由Mason等在1962年从链霉菌林可变种培养液中获得的一类高效广谱的抗生素.国内林可霉素厂家发酵产物以林可霉素A为主，同时也含有林可霉素B、C、D等类似物.研究表明，林可霉素 A、B组分的分子结构中仅相差一个CH2，物理化学性质相似，但林可霉素B抗菌活力小，毒性大.因此，为提高林可霉素的药效，减少药物的毒副作用，需要对其进行分离提纯以获得高纯度的林可霉素.

我国各厂家所采用的林可霉素提炼工艺主要是溶剂萃取法，但此法存在工艺复杂、工序繁多、收率低、物耗及能耗高等缺点，故寻找出一种高效提高林可霉素A的纯度的方法是至今亟待解决的问题.分子印迹聚合物[2-7]是一种新型的分离材料，对目标分子具有高亲和性和选择性，适用于结构类似的化合物分离，特别是与色谱分析和分离[4-8]，固相萃取[9]等技术的结合已成为研究的热点.

本研究运用分子印迹技术，首次以林可霉素A为模板分子，采用单步溶胀法[10-12]制备球形的分子印迹聚合物，并对其吸附性能进行研究，为进一步研制出有效分离林可霉素各组分的方法提供实验基础.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂 苯乙烯；甲醇；冰醋酸；氯仿；偶氮二异丁腈；过二硫酸钾；邻苯二甲酸二丁酯；α-甲基丙烯酸；氯化钠；十二烷基硫酸钠；聚乙烯醇；乙二醇二甲基丙烯酸酯；盐酸林可霉素.

1.1.2 仪器 JY92-2D超声波细胞粉碎仪；JSM-5510LV扫描电子显微镜；马尔文激光粒度分析仪；Nicolet 6700傅立叶红外光谱仪；UV-1600紫外分光光度计；氮气吹干仪；SXT-06索氏提取器；1260安捷伦高效液相色谱；DZF-6050真空干燥箱；旋转蒸发仪；TG18M高速离心机；恒温振荡器.

1.2 方法

1.2.1 紫外光谱分析 称取适量的林可霉素加入容量瓶中，用氯仿稀释定容，配制浓度为4 mmol/L的溶液，固定该浓度，按1∶0、1∶2、1∶4、1∶6的比例加入功能单体MAA，25 ℃下振荡24 h后，以相应浓度的MAA氯仿溶液作为参比，测定林可霉素紫外吸收光谱的变化.

1.2.2 分子印迹聚合物烯微球的制备a.聚苯乙烯微球制备.将70 mL超纯水、0.087 g氯化钠、10 g苯乙烯单体加入锥形瓶中，室温下水浴超声分散40 min，然后将溶液转入到四口瓶，通入氮气20 min后加入30 mL 2.5 mmol/L脱氧过硫酸钾水溶液，在氮气保护下，70 ℃恒温反应20 h.反应结束后，冷却至室温，将获得的乳液用超纯水反复离心洗涤干燥后重新分散到水中，配成0.2 g/mL的分散液.

b.林可霉素A分子印迹聚合物烯微球的制备.称取0.406 g林可霉素溶解于5 mL氯仿中，加入0.34 g的甲基丙烯酸(MAA)、3.96 g乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、1.96 g邻苯二甲酸二丁酯和0.2 g偶氮二异丁腈，溶解混合均匀后加入50 mL 0.1%(质量比)十二烷基硫酸钠和1.0%聚乙烯醇混合液，超声分散均匀，加入2.0 mL聚苯乙烯微球分散液，25 ℃下以150 r/min速度搅拌溶胀20 h.通入氮气保护，70 ℃反应20 h.非印迹聚合物微球的制备方法与上述相同，只是在制备过程中没有加入模板分子林可霉素A.

c.洗脱处理.将获得的颗粒置于索氏提取器中，以甲醇∶冰醋酸(9∶1)为溶剂萃取24 h除去模板分子，再用甲醇继续萃取5 h除去冰醋酸，最后用水洗去残留的甲醇，20 ℃真空干燥至恒重.

1.2.3 红外光谱分析 采用傅立叶红外光谱仪对MIPMs、MAA、EDMA进行光谱分析.

1.2.4 分子印迹聚合物微球的形貌及粒径分析 采用扫描电镜观测MIPMs的形貌，并用粒度分析仪对微球的粒径进行分析.

1.2.5 林可霉素的含量检测 吸附液中林可霉素的含量分析，采用高效液相色谱法.色谱条件：流动相为0.05 mmol/L的四硼酸钠水溶液(用浓盐酸将pH值调至6)：甲醇(体积比6∶4)；色谱柱为Phenomenex C18柱(4.6 mm×100 mm，5 μm)；柱温25 ℃；流速1 mL/min；进样量5 μL；检测波长UV为214 nm.

1.2.6 分子印迹聚合物微球的结合性能研究 为研究MIPMs对模板分子的结合特性，取50 mg MIPMs和NIPMs分别置于25 mL锥形瓶中，加入不同浓度的林可霉素氯仿溶液， 25 ℃下恒温振荡24 h，然后将其混合物用0.45 μm微孔滤膜过滤，精密移取2 mL滤液用氮气吹干，甲醇稀释定容，通过高效液相色谱法测定吸附前和吸附平衡后溶液中的林可霉素A的浓度.

利用式(1.1)计算单位质量MIPMs和NIPMs对底物的吸附量Q：

(1.1)

式中，Q为分子印迹聚合物微球对底物的吸附量(μmol/g)；C0为吸附前底物的初始浓度(mmol/L)；C为吸附后溶液中底物的浓度(mmol/L)；V为吸附液的体积(mL)；m为吸附剂的质量(g).

为分析MIPMs对模板分子的识别特异性，称取50 mg MIPMs和NIPMs分别置于25 mL锥形瓶中，加入10 mL 1 mol/L的林可霉素粗品氯仿溶液，按相同的方法测定其含量.

利用式(1.2)计算结合分配系数KD：

(1.2)

式中，Cp为分子印迹聚合物微球结合底物的浓度(μmol/g)；Cs为溶液中底物的平衡浓度(mmol/L).

利用式(1.3)计算分离因子α：

(1.3)

式中，α表示A，B两种物质的分离因子；KA表示A物质在分子印迹聚合物微球吸附后的分配系数(mL/g);KB表B物质在分子印迹聚合物微球吸附后的分配系数(mL/g).

2 结果与讨论

2.1 紫外光谱研究模板分子与功能单体的作用力

紫外光谱分析模板分子林可霉素和功能单体MAA在氯仿中结合的情况.

图1 林可霉素在不同浓度的MAA中的紫外吸收光谱Fig.1 UV adsorption of licomycin in the presence of different concentration of MAA m (lincomycin)/m 注：a) 1∶0; b) 1∶2; c) 1∶4; d):1∶6.

图1中的a、b、c及d曲线分别为4 mmol/L的林可霉素在氯仿中按1∶0、1∶2、1∶4及1∶6的比例加入MAA后的紫外光谱的变化.由图可知，随着MAA浓度的增加，林可霉素的最大紫外吸收波长出现红移，且波峰强度不断降低，这可能是由于林可霉素羰基中的氧原子与MAA中羟基的氧原子产生了较强的相互作用，推测为O…H―O的氢键作用.

2.2 红外光谱分析分子印迹聚合物微球的结构

红外光谱分析功能单体和交联剂的共聚情况、以及模板分子与功能单体之间发生作用的功能基团.

图2 MAA (a)、EDMA (b)及MIPMs (c)的红外光谱图Fig.2 IR of spectrum of MAA (a), EDMA (b) and MIPMs (c)

2.3 分子印迹聚合物微球的表观形貌及粒径

扫描电镜观察林可霉素A分子印迹聚合物微球的表观形态.

图3 MIPMs的扫描电镜照片Fig.3 SEM of MIPMs

由图3可知，MIPMs虽然表面有些粗糙，但是粒度均匀，单分散性良好.同时经激光粒度分析仪检测，其平均粒径为2.58 μm，基本符合色谱柱对微球粒径的要求.

2.4 分子印迹聚合物微球的结合性能研究

2.4.1 MIPMs的结合特性 研究MIPMs的结合特性，在林可霉素A浓度0～3.5 mmol/L的范围内，测定MIPMs和NIPMs的结合等温线.

图4 MIPMS和NIPMs的结合等温线Fig.4 Binding isotherm of MIPMs and NIPMs

图4中的a和b分别为MIPMs和NIPMs对林可霉素A的结合等温线.比较图4中的a、b曲线可知，MIPMs对林可霉素A的结合量高于NIPMs的，说明林可霉素A在MIPMs中留下的印迹孔穴及孔穴上的活性结合位点决定了MIPMs 对林可霉素A的亲合力.

2.4.2 MIPMs的特异识别性能 选用林可霉素A的结构类似物林可霉素B作为竞争底物考察MIPMs的识别性能(表1).

表1 MIPMs与NIPMs对林可霉素A和林可霉素B的吸附性能Table 1 capabilities of MIPMs and NIPMs to lincomycin A and lAdsorptionincomycin B

由表1可知，MIPMs和NIPMs分别对林可霉素A和林可霉素B两底物的吸附性能存在一定的差异.MIPMs对林可霉素A有一定的选择吸附能力，其分离因子α为1.27.NIPMs对两底物的吸附能力基本相当，其分离因子α仅为1.02.这种差异表明，通过单步溶胀聚合法制得的MIPMs对模板分子具有识别性能.

4 结 论

以大粒径的单分散聚苯乙烯微球为种球、林可霉素A为模板分子，采用单步溶胀聚合法制备林可霉素A的分子印迹聚合物微球.通过对其结构的表征和识别性能的测定，表明该材料对林可霉素A具有一定的亲和性和选择性，对林可霉素A和林可霉素B的分离因子α为1.27，而非印迹聚合物微球的分离因子α仅为1.02.该分子印迹聚合物微球有望用于林可霉素粗品的分离、纯化.

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