链脲佐菌素建立I型糖尿病大鼠模型的剂量研究①

杨 竞，徐 洋，蔡春荣，李利生，高 杨，杨丹莉

(遵义医学院药理教研室暨贵州省基础药理重点实验室，贵州 遵义 563000)

1型糖尿病(TIDM)是一种自身免疫性疾病，它导致胰岛 β细胞损害，继而胰岛素缺乏［1］。TIDM能引起代谢紊乱、血管和神经损害、全身多器官功能障碍，使患者寿命缩短，生活质量严重降低。至今，TIDM的具体发病机制仍不清楚，目前尚无药物可彻底治愈TIDM。TIDM防治及研究仍然是焦点。因此建立一种较理想TIDM动物模型具有重要的意义。链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)，在上世纪50年代被证实具有抗菌、抗肿瘤作用［2］。Rackienten和 Junod发现 STZ具有致TIDM作用。STZ对胰岛β细胞具有特异毒性，使胰岛破坏，胰岛素缺乏，能很好地模拟TIDM的病程，是建立糖尿病动物模型的常用方法之一。但是目前关于STZ诱导TIDM 的剂量众说纷纭［3～5］，使研究者深感困惑，希望找到理想的STZ造模剂量。因此，本研究组在过去研究的基础上，选择50，65mg/kgSTZ，研究其对SD大鼠的血糖、血胰岛素、胰腺病理形态学的影响，旨在探索STZ制造TIDM动物模型的理想剂量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 成年 SD大鼠，雄性，体重(320±10)g，购自重庆第三军医大学动物实验中心，许可证号为SCXK～(军)2007～017。

1.1.2 试剂 STZ购自 sigma公司;碘［125I］胰岛素放射免疫分析试剂购自北京科美生物技术有限公司;柠檬酸缓冲液，配制成0.1 mol/L，pH值4.2。

1.1.3 仪器 血糖仪及血糖试纸(稳步型)，购自强生公司。

1.2 方法

1.2.1 分组 实验前用血糖仪测定大鼠空腹血糖，根据美国糖尿病协会(ADA)推荐的诊断标准血糖在3.15～6.19 mmol/L方能入选。入选的38只成年健康雄性SD大鼠随机分为三组，其中STZ 55组、STZ65组各16只，对照组6只，分别腹腔注射STZ55 mg/kg(STZ55组)、65 mg/kg(STZ65组)和等体积柠檬酸缓冲液(对照组)。

1.2.2 TIDM模型的制备 所有大鼠在造模前禁食12 h，临用前以柠檬酸缓冲液将STZ配制成1%溶液。给予STZ后大鼠即出现多饮多食多尿的症状，48 h后测其空腹血糖，血糖≥7.0 mmol/L并持续升高，第7天空腹血糖≥11.1 mmol/L可视为造模成功。成模后每周检测体重及空腹血糖，观察大鼠的一般状况。

1.2.3 观察各组大鼠成模率(成模率=成模大鼠数量/造模大鼠数量)及死亡率(死亡率=死亡大鼠数量/造模大鼠数量)。

1.2.4 第28天，所有大鼠以10%水合氯醛麻醉，取血清，同位素放射免疫试剂法测血清胰岛素(INS)。

1.2.5 取各组大鼠胰腺组织以4%多聚甲醛固定48 h，脱水，包埋，HE染色，观察其形态学改变。

2 数据统计处理

数值数据以均数(x)±标准差(S)表示，应用SPSS 12.0进行统计学分析处理，单因素方差分析进行差异比较。

3 结果

3.1 STZ对大鼠一般情况的影响 STZ55，STZ65组大鼠造模成功后均出现精神萎靡，活动度差，毛晦暗脱落，进食量及饮水量增至造模前两倍，尿量明显增多，垫料潮湿且有酸臭味，需每日更换垫料2次。对照组无明显变化。

3.2 STZ对动物死亡率及模型成功率的影响 对照组(n=6)大鼠未见死亡及空腹血糖升高。STZ55组分别于第27、28天各有1只大鼠死亡，同时，1只造模后第2天空腹血糖＜7.0 mmol/L且不升高，3只第7天 ＜11.1 mmol/L，视为未成模。STZ65组于第14、17、20、22天分别有 1只大鼠死亡;2只第7天＜11.1 mmol/L视为未成模。结果(见表1)。

表1 不同剂量的STZ所致1型糖尿病(TIDM)模型的成模率及死亡率

3.3 STZ对大鼠体重变化的影响 与对照组比较，STZ55，STZ65组成模大鼠体重均明显减轻(均P＜0.05)，但第3周开始，STZ55组与STZ65组体重变化出现明显差异。STZ55组体重开始增加，而STZ65组体重继续减轻。结果(见图1)。

图1 STZ对大鼠体重影响( s，g)

3.4 STZ对大鼠空腹血糖的影响 造模后STZ55、STZ65组空腹血糖较对照组均显著升高(均P＜0.05)。但第14天后STZ55组空腹血糖未见继续升高，且略有下降。STZ65组空腹血糖第2、7、21、28天都高于STZ55组(均P＜0.05)，一直稳定在高水平(≥16.7 mmol/L)，且保持升高趋势。结果(见图2)。

3.5 STZ对大鼠血清胰岛素(INS)的影响 与对照组相比，STZ 55和STZ65组血清INS显著降低(P＜0.05)，且STZ65组血清INS水平较STZ55组更低(P＜0.05)，结果(见表2)。

3.6 STZ对大鼠胰腺组织形态的影响 与对照组相比，STZ55和STZ65组大鼠胰腺组织出现异常变化，胰岛正常结构被破坏，数目减少、面积变小。而STZ 65较STZ 55组胰岛减小、结构破坏更明显，结果(见图3)。

图2 STZ对大鼠空腹血糖影响(s，mmol/L)

表2 STZ对大鼠血清胰岛素(INS)水平影响 (x ± s，μIU/ml)

图3 STZ对大鼠胰腺组织形态的影响(HE染色，×400)

4 讨论

TIDM的制备方法多样，主要有化学试剂法、手术切除法、激素注射法、病毒诱导法、转基因及自发糖尿病动物等。虽然手术切除部分胰腺的方法制造的糖尿病模型较稳定，但对术后并发症较多;激素注射法所需造模周期长，且停药后可出现血糖自发恢复，目前已较少应用;病毒诱导的糖尿病模型虽有一定的发展前景，但其成模率相较其他几种方法较低，也伴有较严重的不良反应作用，其应用同样受到限制;转基因动物模型能自发产生糖尿病，但饲养条件要求较高且动物价格昂贵，有一定的局限性。化学试剂法常用的试剂有STZ和四氧嘧啶，其中四氧嘧啶虽可制造糖尿病模型，但有较大的肝、肾毒性，且动物存活率低［6］。STZ对胰岛β细胞具有特异的毒性，其致糖尿病作用可能通过其本身含有的葡萄糖部分结构被胰岛B细胞上低亲和力的葡萄糖转运蛋白(GLUT2)转运，特异性地作用于胰岛B细胞并引起其结构破坏和胰岛素分泌功能障碍［7］、过度激活多聚 ADP 核糖聚合酶［8］、抑制O2连接氮乙酰葡糖胺糖苷酶［9］、使胰腺组织DNA的甲基化水平增高［10］等有关。而STZ诱导的糖尿病模型动物死亡率较低，成模率较高，模型稳定，操作方便，价格相对低廉，是目前国内外最常用的造模方法。但其诱导的TIDM的成模率与死亡率均与剂量有密切关系，大剂量可能导致动物存活率过低，而剂量过小可能导致成模率低。因此，选择合适的剂量是造模的关键因素。

文献报道 STZ制造 TIDM 的剂量包括50［11］、55［10］、60［5］、65［12］、70［4］及 75［3］mg/kg 等。本课题组经过预实验研究最终选择55 mg/kg、65 mg/kg STZ进行正式研究。结果发现一次性腹腔注射55、65 mg/kg STZ后，动物均出现多饮多食多尿、体重减轻、困倦;血糖升高、血胰岛素水平降低等表现。STZ55组造模后3～4周空腹血糖比同时期对照组高，但较两周前的血糖值有所降低。其体重变化也呈类似趋势。这些变化提示55 mg/kg STZ所致的TIDM的模型不够稳定，分析原因可能与该剂量较小有关。与此现象不同的是:STZ65组血糖持续升高，体重持续下降，血胰岛素水平下降程度更低，胰岛破坏、缩小、结构紊乱较STZ55组更为严重，甚至胰岛消失。虽然STZ65组死亡率是STZ55组的1倍，但其成模率为 87.5%，比 STZ55组增加12.5%。本研究揭示一次性腹腔注射STZ65mg/kg是建立SD大鼠TIDM模型理想剂量。

［1］侯萍，刘骁，殷晓丽.1型糖尿病发病机制的研究进展［J］.中国实用医药，2010，5(15):262 －263.

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［6］高红莉，刘方永，夏作理，等.实验性糖尿病动物模型的理论研究与应用［J］，中国临床康复，2004，9(3):210-2.

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