达英-35对PCO模型大鼠中卵巢组织cx43表达的影响

戴碎平 王永红

（山西医科大学第二临床医学院妇产科，山西 太原 030001）

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一种以高雄激素血症，胰岛素抵抗，稀发排卵，和卵巢多囊样改变的在育龄妇女中比较常见的临床综合征。发病率在育龄期妇女中为5%～10%。持续性无排卵，不孕，雄激素过多和胰岛素抵抗是其重要特征，是生育期妇女月经紊乱最常见的原因，其病因至今尚未阐明。连红梅等[1-2]研究表明cx43在多囊卵巢大鼠卵巢中有表达。我们前期研究证实，来曲唑诱导的多囊卵巢模型大鼠是成功的，可以降低多囊卵巢模型大鼠的高雄激素血症。本研究在此基础上进一步探讨达英-35在多囊卵巢模型大鼠卵巢组织cx43的表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：6周龄SD雌性大鼠，体质量约150g，清洁级别：清洁级，河北医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK （冀）2008-1-003，合格证编号1109112。

1.2 药物

来曲唑：购买于江苏恒瑞医药公司，化学式：1-[双（4-氰基苯基）甲基]-1，2，4-三氮唑），生产批号是H19991001；达英-35：购买于拜耳医药公司，批号201000003；睾酮测定试剂盒（直接化学发光法）：产品编号：07207660（110782）。黄体生成素测定试剂盒（直接化学发光法）：产品编号0175629 （110752）；卵泡刺激素测定试剂盒（直接化学发光法）：产品编号04912924（110755）；生产厂家：SIEMNS HEALTHCARE DIANOSTICS INC；冰王脱毛膏-上海冰王生物科技发展有限公司。

1.3 PCO大鼠模型的建立及分组

应用Kafali[3]造模法建立动物模型，6周龄SD雌性大鼠36只，选至少有4d的规律动情周期，完全随机分为3组，即正常对照组、PCOS模型组和达英-35组，每组均为12只。每只大鼠均给以颗粒性鼠料和水，光照12h/d，每日取阴道分泌物，采用瑞士染色，监测动情周期。正常对照组用灌胃针灌服1%羧甲基纤维素（CMC），其余各组均灌胃服用来曲唑1mg/（kg·d）溶于1%CMC中，连续灌服21d之后，各组行剪尾采血，检测血清FSH、LH、T、水平符合PCOS大鼠模型标准者进行实验研究，其中模型组和达英-35组有两只由于操作不当死亡2只。剩余34只。

1.4 实验方法

达英-35（炔雌醇环丙孕酮）组为自9周龄起，按人与大鼠公斤体质量折算系数给药，将药物溶于1% CMC（1mL/100g）给药，1次/d，连续3周；同时给予正常对照组和模型组大鼠同体积1% CMC （1mL/100g），1次/d，连续21d。到12周龄整时，禁饮食12h，应用6%水合氯醛（1mL/100g）行腹腔内麻醉，心脏取血5mL，3000r／min离心，10min分离血清，-20℃保存；取出一侧卵巢后置于福尔马林中固定3d。另一侧卵巢放于-70℃冻存备用作Western blotting。

1.5 血清性激素测定

应用化学发光方法测定睾酮，促卵泡激素、促黄体生成激素、以观察内分泌改变。试剂盒由SIEMNS HEALTHCARE DIANOSTICS INC公司提供，质控符合要求。

1.6 石蜡包埋切片

用石蜡包埋卵巢组织，以4μm厚度连续切片四次。石蜡块的制备的步骤如下：首先，将卵巢组织固定24h，从固定液中取出卵巢组织，修剪脂肪组织，最大限度的暴露卵巢组织，放入小铜盒入用来水冲洗12h，放入70%酒精过夜。其次，酒精脱水由低浓度到高浓度：组织放入70%酒精1h→80%酒精1h→90%酒精1h→95%酒精Ⅰ1h→95%酒精Ⅱ1h→100%酒精Ⅰ30min→100%酒精Ⅱ30min→酒精∶二甲苯（1∶1）30min。再次，分别放入二甲苯Ⅰ1h透明→二甲苯Ⅱ30min透明。最后，蜡缸Ⅰ浸蜡1h后，放入蜡缸Ⅱ浸蜡1h，再放入蜡缸Ⅲ浸蜡1h。

1.7 免疫组织化学染色法

采用免疫组织化学染色的方法，观察卵巢组织中cx43的表达，cx43一抗为兔抗鼠多克隆抗体，一抗稀释比例为1∶50-200由美国bioworld公司提供。封闭液：5%BSA 3mL，用于组织切片的封闭。二抗：聚合HRP标记抗兔IgG（武汉博士德生物工程有限公司）。图像灰度值分析系统进行灰度值测定。免疫组化染色步骤：①石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（pH7.4）冲洗3次，每次3min（3×3′）。②根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。③如果有必要，每张切片加1滴（试剂A）室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS（pH7.4），每2min，冲洗3次。④除去PBS液，每张切片加1滴或50μL的第一抗体，4℃过夜，PBS（pH7.4），每2min，冲洗3次。⑤滴加聚合HRP标记抗兔IgG，37度孵育30min。⑥DAB显色。⑦苏木精轻度复染，脱水，透明，封片，观察。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 PCOS动物模型

2.1.1 动情周期的变化：阴道涂片并行瑞氏染色后，可见模型组在应用来曲唑21d后动情周期失去规律性变化，提示无排卵。对照组仍保持规律的动情周期变化。

2.1.2 卵巢组织学改变：HE染色镜检可见模型组膜细胞层增厚；有较多早期发育的小卵泡和闭锁卵泡；囊状扩张卵泡明显增加。颗粒细胞层减少至2～3层，卵泡内卵母细胞或放射冠消失，黄体数量明显下降且伴有不完全的黄素化，间质细胞明显增生，未见排卵前卵泡及排卵迹象。染色镜检结果见图1。

2.1.3 与正常对照组比较：模型组大鼠血清LH、T、FSH水平明显升高（P＜0.05），其余两组性激素水平差异无显著性（P＞0.05）。

图1 染色镜检结果

2.1.4 与模型组比较：达英-35组、正常对照组大鼠血清LH、T、FSH水平明显降低（P＜0.05）。

2.1.5 与达英-35组比较：正常对照组、大鼠血清性激素无显著性差异（P＞0.05）。见表1

表1 药物干预后各组大鼠性激素水平的比较

2.1.6 cx43在卵巢组织中的表达：光镜下可见cx43主要在卵巢颗粒细胞中表达，在模型组表达水平显著低于正常对照组（P＜0.05）。达英-35组表达水平显著高于模型组组（P＜0.05）。见表2。

表2 三组Cx43表达水平灰度值比较(±s)

表2 三组Cx43表达水平灰度值比较(±s)

注：模型组与正常对照组比较：P＜0.05；与达英-35组与正常对照组比较：P＞0.05

组别 n cx43正常对照组 12 149.590± 9.25 PCO模型组 11 98.1945± 6.51达英-35组 11 143.794±9.81 F 65.842 P 0.000

3 讨 论

多囊卵巢综合征是育龄妇女中最常见的内分泌紊乱的一种临床综合征。发病机制包括内容广泛，包括神经、内分泌、代谢系统和卵巢局部的调控因素。其病因至今尚未阐明，成为目前妇科内分泌领域内最复杂的研究热点。我们前期研究[3]已经证实了来曲唑诱导的多囊卵巢模型大鼠是成功的，本研究在此基础上进一步探讨达英-35对多囊卵巢模型大鼠卵巢组织cx43的表达的影响。

3.1 cx43与PCO模型大鼠卵巢组织中的表达水平及意义

cx43是卵巢组织间隙连接中表达最多的连接蛋白，由基因Gjal编码cx43蛋白。连接蛋白是间隙连接的基本结构单位和功能基础。有两个基因位点位于人类卵巢组织中：定位于6号染色体上是功能基因，定位于5号染色体上是假基因。编码人类cx43的基因位于6q22.3，全长约3.0kb[4]。cx基因家族是保守的，不同的cx具有共同的结构特征。cx43分子质量为43kD，其蛋白质肽链由382个氨基酸构成，其中1～242位氨基酸构成管道部分，243～382位构成细胞质尾部[5]。cx43主要表达在成熟卵泡卵丘上的颗粒细胞间。Gershon等[6]研究显示cx43的下调会影响卵子产生，卵泡的发育，排卵功能，导致排卵障碍，影响早期胚胎的发育。Carabatsos等[7]研究表明，cx43影响卵泡发育可能有以下几个方面：它促进正常卵泡的发育，同时使得颗粒细胞能够增多分层和正常增殖。在选择卵泡和促进卵泡凋亡方面发挥有益作用。在排卵、黄体形成、分化和退化中也发挥有利作用。在卵巢卵泡生理过程中发挥也重要作用。Gilchrist等[8]在研究中观察到，细胞间缝隙连接GJC在减数分裂中起重要作用：如促进卵母细胞新陈代谢、卵母细胞的细胞质成熟及卵母细胞发育。

本实验研究结果显示，本实验研究结果显示，与正常对照组相比较，在模型组中卵巢颗粒细胞中cx43的表达水平降低，cx43表达降低是PCOS发生发展的一个病理基础。在卵巢颗粒细胞中表达的cx43水平异常下降，以自分泌或旁分泌的形式作用于邻近颗粒细胞，也可以作用于邻近卵泡细胞和周围原始卵泡的形成，导致其激素分泌活动水平的异常变化，这可能是形成了PCOS的明显的高雄激素血症和卵巢呈多囊性改变等重要基础。

3.2 达英-35组对多囊卵巢模型大鼠卵巢组织中cx43表达的影响

达英-35不仅可以逆转PCOS模型大鼠卵巢组织形态学表现，进一步从细胞因子水平探讨可能通过达英-35恢复排卵。实验结果显示，达英-35组具有升高cx43水平、改善多囊卵巢征象、恢复排卵的作用。本实验研究通过观察达英-35对多囊卵巢模型大鼠的卵巢组织中cx43的表达情况，揭示达英-35对改善多囊卵巢模型大鼠的卵巢结构和功能发挥着作用。经达英-35组治疗后，大鼠卵巢组织中cx43增多。由此可见，达英-35组可以改善高雄激素血症，是各种激素和因子相互促进和制约，调节下丘脑一垂体一卵巢轴的功能得以恢复，使卵巢内环境发生改变，卵巢的局部调控恢复正常，有效的改善PCOS卵泡发育和成熟障碍，颗粒细胞增殖和分层障碍，卵母细胞发育不成熟或者缺失，稀发排卵。cx43在正常卵巢组织广泛表达而又被广泛研究的连接蛋白，深入研究与之相关的蛋白，更有利于我们深刻地阐明该分子的功能，也有助于理解因cx43调控导常而引起的一些相关疾病分子机制，也为我们今后探索新药物提供了理论依据。

[1] 连红梅,贾莉婷,张展.间隙连接蛋白Cx43和Cx37在多囊卵巢综合征大鼠卵巢中的表达及意义[J].中国妇幼保健,2008,28(34):4622-4623.

[2] Kafali H,Iriadam M,Ozardl I.Letrozole-Induced PolycysticOvaries in the rat: A New Model for Cystic Ovarian Disease[J].Archives of Med Res,2004,35(10):103.

[3] 王永红,王洪丽.炔雌醇环丙孕酮对多囊卵巢综合征大鼠卵巢组织形态学的研究[J].中国药物与临床,2011,11(12):1968-1970.

[4] 王永红,王洪丽.复方甘芍贴剂对多囊卵巢综合征大鼠模型的研究[J].中国中西医结合杂志,2012,32(3):437-440.

[5] Tennissen BE,Bierhuizen MF.Ttansiptional control of myocardial connexins[J].Cardiovasc Res,2004,62(2):246-255.

[6] Yancey SB,John SA,Lal R,et a1.The 43-kD polypeptide of heart gap junctions:immunoloealization,topology,and functional domains[J].J Cell Biol,1989,108(6):2241-2254.

[7] Carabatsos MJ,Sellitto C,Goodenough DA,et al.Ocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence[J].Dev Biol,2000,2(26):167-179.

[8] Gilchrist RB,Lane M,Thompson JG.Oocyte-secreted factors:regulators of cumulus cell function and oocyte quality[J].Hum Reprod Update,2008,14(2): 159-177.