芍药苷对过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞PCNA及Caspase-3表达的影响

周 洁，曹鹏涛，冯凯祥，贾岩岩，罗雪婷，潘梦音，温新丽，于甜甜，杨五彪

·基础医学·

芍药苷对过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞PCNA及Caspase-3表达的影响

周 洁，曹鹏涛，冯凯祥，贾岩岩，罗雪婷，潘梦音，温新丽，于甜甜，杨五彪

目的探讨芍药苷对过氧化氢（H2O2）诱导SH-SY5Y氧化损伤的保护作用及其可能机制。方法MTT法测定细胞存活率，细胞免疫化学技术检测细胞细胞核增殖抗原（PCNA）、Caspase-3的表达。结果0.87 mmol／L H2O2可使细胞存活率降低，PCNA的表达减少，Caspase-3的表达增加。经过39μg／m L和62.5μg／m L浓度的芍药苷处理后，H2O2诱导的SH-SY5Y细胞存活率明显升高，PCNA的表达明显增加，同时抑制Caspase-3的表达。结论芍药苷可抑制过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞凋亡，其作用机制可能与其增加细胞PCNA的表达，减少Caspase-3的表达有关。

芍药苷；过氧化氢；SH-SY5Y细胞；凋亡

凋亡是神经细胞死亡的主要机制，而且病灶周围都要产生大量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）。细胞内ROS累积、线粒体膜电位（MMP）下降是氧化应激诱导细胞凋亡、引起细胞损伤的关键因素［1］，因此可以把减轻氧化应激作为药物作用的靶点之一，用于神经保护药物的筛选。芍药苷（paeoniflorin，PF）具有抗自由基损伤，提高用于清除ROS的抗氧化物活性及降低MDA水平，对D-半乳糖和亚硝酸钠诱导的神经元损伤具有保护作用［2］。本文用H2O2造成人神经母细胞瘤细胞株（SH-SY5Y）细胞凋亡模型，观察不同浓度芍药苷对SH-SY5Y细胞的抗凋亡效果，以探讨芍药苷对神经元细胞保护的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂芍药苷（西安昊轩生物科技有限公司，批号：20110518，纯度为98%），四唑盐（MTT），小牛血清、DMEM（Gibco BRL公司）。

1.2 细胞培养及药物处理人神经母细胞瘤细胞株（SH-SY5Y）（中国科学院上海细胞生物学研究所）。细胞用含2 mmol／L谷氨酰胺和10%小牛血清的DMEM培养基，在37℃5%CO2培养箱中培养。隔天传代细胞，当传代细胞在倒置显微镜下观察均匀贴壁生长时，可用于实验研究。

1.3 M TT法检测H2O2对SH-SY5Y细胞的损伤作用将生长状态良好的SH-SY5Y细胞以1×104细胞／孔接种于96孔板，待细胞贴壁。细胞贴壁后弃去培养液，每孔加含不同浓度H2O2的培养液200 μL。阴性对照组加不含H2O2的培养液200μL。继续培养44 h每孔加入5 mg／m L MTT溶液20μL，继续培养4 h后弃去培养液，每孔加入200μL DMSO，震荡5 m in后酶标仪检测490 nm处每孔的吸光度（OD）值。细胞存活率＝给药组OD值／阴性组OD 值×100%。Orgin软件计算半数抑制率（IC50）。

1.4 M TT法测定PF对H2O2、SH-SY5Y细胞损伤的保护作用取对数生长期的SH-SY5Y细胞，以1 ×104细胞／孔接种于96孔板，待细胞贴壁。细胞贴壁后模型组以0.87 mmol／L H2O2作用于SH-SY5Y细胞。治疗组分别以不同浓度PF和0.87 mmol／L H2O2作用于SH-SY5Y细胞。治疗组PF以7.8～1 000μg／m L作用于SH-SY5Y细胞。对照组只加SH-SY5Y细胞，不加药物。细胞给药44 h每孔加20 μL浓度为5 mg／m L的MTT溶液。继续培养4 h后弃去培养液，每孔加入200μL DMSO，震荡5 m in后酶标仪490 nm处检测吸光度值（OD）。检测方法同方法1.3。

1.5 细胞免疫化学技术检测细胞PCNA、Caspase-3的表达取对数生长期SH-SY5Y细胞消化制备细胞悬液，调整细胞浓度为1×104／m L，接种于内置无菌玻片的9孔板内（2 m L／孔）。培养24 h后，分6组，芍药苷终浓度分别为39和62.5μg／m L，对照组不加药物。以上各组平行3孔，继续培养48 h后，爬片用PBS漂洗2遍，经4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤后自然风干。检测方法按免疫组化试剂盒说明书进行。

1.6 统计学处理采用SPSS 16.0软件进行统计分析。测定值以±s表示，组间比较用t检验。

2 结果

2.1 过氧化氢及芍药苷对SH-SY5Y细胞存活率的影响 MTT分析表明，0～6.0 mmol H2O2的处理48 h，呈浓度依赖性地降低SH-SY5Y细胞的存活率。而H2O2对SH-SY5Y细胞IC50为0.87 mmol／L，见图1和图2。

2.2 SH-SY5Y细胞PCNA、Caspase-3的表达结果PCNA表达于细胞核中，而Caspase-3表达于细胞质中，染色阳性信号呈棕黄色。与空白组相比，模型组SH-SY5Y细胞PCNA的表达明显减少，Caspase-3的表达明显增多；芍药苷组PCNA表达显色则较模型组明显增强，呈强阳性染色，且阳性细胞数明显增加，Caspase-3的表达明显减少。见图3和图4。应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡［6］。芍药苷具有免疫调节、镇痛、保肝、抗肿瘤、抗炎、改善学习记忆行为等作用，研究发现，芍药苷对神经元的生长存活具有促进作用，并可显著提高多种钙超载损伤模型中的大鼠神经细胞的存活数［7］。

图1 不同H2O2浓度对细胞存活率的影响

图2 芍药苷抗H2O2诱导SH-SY5Y细胞细胞毒性

图3 芍药苷对H2O2诱导SH-SY5Y细胞PCNA表达的影响

图4 芍药苷对H2O2诱导SH-SY5Y细胞Caspase-3表达的影响

本文以H2O2处理SH-SY5Y细胞，制备氧化应激损伤模型，探讨PF对过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞凋亡的抗氧化作用。本实验结果显示，PF可以减轻H2O2诱导的SH-SY5Y细胞毒性作用，而在39～312.5 μg／m L范围内呈浓度依赖性的抑制H2O2引起的细胞毒性作用明显提高细胞的存活率，提示PF具有神经细胞保护作用，能对抗H2O2引起的细胞凋亡。H2O2损伤后SH-SY5Y细胞核增殖因子PCNA的表达则明显减少，Casepase-3的表达明显增加，而PF能明显促进PCNA表达，同时抑制Casepase-3的表达。PF具有抗氧化应激损伤的效应，增加了细胞的存活率，同时明显促进PCNA表达，抑制Casepase-3的表达，为进一步研究芍药苷的神经保护作用提供了依据。

3 讨论

近年来，氧化应激被认为是一些神经退行性疾病、帕金森综合征以及多发性硬化症等严重危害人类健康疾病的主要原因。其中活性氧在神经退行性疾病的发病过程中扮演着举足轻重的角色，脑组织的氧化代谢率很高，过氧化氢酶活性低，比其他部位更容易受到活性氧作用的影响。氧化应激诱发的自由基损伤是导致神经元凋亡的基本原因之一，因此抗氧化是保护神经元的有效途径。

H2O2是氧化应激反应密切相关的活性氧之一，其主要产物具有很强的氧化性并可自由进入细胞，在许多神经元细胞培养模型中可引起细胞损伤，且许多中枢神经系统疾病都涉及到氧化应激损伤［3－4］。增殖细胞核抗原（PCNA）是DNA聚合酶δ的辅助蛋白，参与调节DNA的合成，与细胞的增殖周期密切相关。PCNA是伴随细胞增殖而表达的一种核内蛋白，可作为一项评估细胞增殖状态的指标［5］。Casepase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Casepase-3为关键的执行分子，与DNA断裂、染色质凝聚和凋亡小体形成有关。Casepase-3在正常状态下以酶原的形式存在于胞浆中，没有活性，但在细胞发生凋亡阶段，它被激活，活化的Casepase-3由两个大亚基和两个小亚基组成，它可以水解多聚ADP核糖多聚酶（PARP），裂解相

［1］ Mandemakers W，Morais VA，De Strtmper B.A cell biological per-spective on m itoehondrial dysfunction in Parkinson disease and other neurodegenerative diseases［J］.JCell Sci，2007，120 （10）：1707－1716.

［2］ 李乔，钟树志，马世平.芍药苷对D-半乳糖和亚硝酸钠诱导的大鼠认知障碍与神经元变性的改善作用［J］.药学与临床研究，2009，17（3）：172－174.

［3］ Zhang XJ，Chen HL，Li Z，et al.Analgesic effect of paeoniflorin in rats with neonatal maternal separation-induced visceral hyperalgesiaismediated through adenosine A（1）receptor by inhibiting the extracellular signal-regulated protein kinase（ERK）pathway［J］.Pharmocal Biochem Behav，2009，94（1）：88 －97.

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［7］ 姜淼，禹良艳，卞慧敏.芍药苷对KCL诱导原代培养大鼠皮层神经元损伤的保护作用［J］.中国中医急症，2009，18 （6）：937－939.

Effect of Paeoniflorin on Exp ression of PCNA and Caspase-3 in Peroxide-induced SH-SY5Y Cells

ZHOU Jie，CAO Peng-tao，FENG Kai-xiang，et al
（Medical College，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China）

ObjectiveTo study the protective effect of paeoniflorin（PF）on hydrogen peroxide（H2O2）-induced oxidative injury in SH-SY5Y.MethodsTo measure the cell viability of SH-SY5Y with MTT assay，the expression of PCNA and Caspase-3 was determined with immunohistochemicalmethod.Results0.87 mmol／L H2O2could significantly induce oxidative injury of SH-SY5Y cell viability，decrease the expression of PCNA，increase the expression of Casepase-3.In the presence of 39，62.5μg／m L PF，H2O2-induced cell viability was increased.With immunocytochem ical analysis，a up-regulation PCNA expression and a down-regulated Caspase-3 expression was observed.ConclusionPF could protect against H2O2－induced SH-SY5Y cell apoptosis，which mechanism is correlated with PCNA up-regulation and Caspase-3 down-regulation.

peoniflorin；hydrogen peroxide；SH-SY5Y cell；apoptosis

R774

A

1672－688X（2012）04－0241－03

国家自然科学基金项目（31171256）

河南省医学科技攻关项目（201003079）

河南科技大学大学生研究训练计划项目（2012192）

2012－10－12

河南科技大学医学院，河南洛阳471003

周洁（1991－），女，河南陕县人，临床医学2010级在读本科生。

杨五彪，男，教授，E-mail：ywbiao＠mail.haust.edu.cn