响应面法优化油橄榄叶中橄榄苦苷超声辅助提取工艺

闫树军，王 远，苏艳红，饶在生，李 晖

(四川大学化学工程学院，四川 成都 610065)

响应面法优化油橄榄叶中橄榄苦苷超声辅助提取工艺

闫树军，王 远，苏艳红，饶在生，李 晖*

(四川大学化学工程学院，四川 成都 610065)

目的：研究油橄榄叶中橄榄苦苷超声辅助提取最佳工艺条件。方法：选定甲醇体积分数、料液比和提取时间作为影响因素，以橄榄苦苷提取率为评价指标。在单因素试验的基础上，通过3因素3水平Box-Behnken试验，建立橄榄苦苷提取率的二次多项式回归方程，经响应面回归分析得到优化组合条件。结果：最佳工艺条件为甲醇体积分数93.5%、料液比1∶25(g/mL)、提取时间26min。结论：油橄榄叶中橄榄苦苷提取率可达7.83%。

油橄榄叶；橄榄苦苷；超声提取；响应面分析

油橄榄(Olea europare Linn)又名洋橄榄、齐墩果、阿列布等，为木犀科、木犀榄属常绿乔木，主要分布在地中海沿岸国家和美国加州地区，现在世界各国均有栽培[1-2]。研究发现油橄榄叶中含有大量的生物活性物质，主要成分有裂环环烯醚萜及其苷(橄榄苦苷为主要成分)、黄酮及其苷、双黄酮及其苷、低分子单宁等。现代药理研究表明，橄榄苦苷具有抗真菌、抗炎、抗病毒、抗氧化，以及抗癌和降血糖等多种作用[3-4]。

目前油橄榄叶中橄榄苦苷的传统提取方法主要采用水提和醇提法，提取物为含量3%～5%的粗制品，该法得率较低、操作费时、能耗大[5-12]。近年来，超声波辅助提取方法广泛应用于天然产物的提取中，其主要是利用超声波的空化效应增大介质分子的运动速度，使可溶性活性成分迅速溶出，从而提高提取率，缩短提取时间，并且避免高温对提出成分的影响[13-14]。本实验利用超声辅助提取油橄榄叶中橄榄苦苷，采用响应面分析(response surface methodology，RSM)多元二次回归方程来拟合影响因素与响应值之间的函数关系[15]，通过对回归方程进行分析优化工艺参数，为橄榄苦苷提取工艺的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

油橄榄叶购于甘肃；橄榄苦苷对照品(纯度≥98%)成都曼思特生物科技有限公司；甲醇(分析纯)、乙腈(色谱纯) 美国天地公司；高效液相色谱用水为三次蒸馏水。

BS-224S电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；KH-5200DE型数控超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司；1200高效液相色谱仪(配有四元泵及DAD检测器) 美国安捷伦科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 橄榄苦苷的提取

将在60℃干燥至质量恒定的油橄榄叶粉碎后过筛(30～40目)，备用。准确称取一定量的油橄榄叶粉，加入适量甲醇溶液，称量，在100W超声功率下提取一定时间后，冷却至室温，称量，用甲醇溶液补充缺失质量，摇匀，过滤，弃去初滤液，取3 mL续滤液，过0.45μm滤膜，待测，计算油橄榄叶中橄榄苦苷提取率。

式中：C为橄榄苦苷质量浓度/(g/mL)；V为加入甲醇溶液体积/mL；m为油橄榄叶质量/g。

固定试验条件提取时间3 0 mi n、甲醇体积分数90%、提取功率100W、料液比1∶25(g/mL)进行单因素试验，研究各因素对橄榄苦苷提取率的影响。

综合单因素试验结果，采用Box-Behnken试验设计原理，优化超声提取油橄榄叶中橄榄苦苷的工艺条件。

1.2.2 标准曲线的绘制

准确称取橄榄苦苷对照品7.88mg，加甲醇定容至5mL，摇匀，配成质量浓度1.576mg/mL的对照品溶液。分别移取395、315、235、155、80μL用甲醇定容至5mL，以峰面积对质量浓度绘制标准曲线，回归方程：y＝5.593×10-8x(R2＝0.9986)，其中y为橄榄苦苷质量浓度/(mg/mL)；x为橄榄苦苷峰面积/(mAU·s)。结果表明橄榄苦苷在0.025～0.125mg/mL范围内线性关系良好。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent extend C18(150mm×4.6mm，5μm)；柱温30℃；流动相：乙腈-水(21∶79，V/V)[16]；检测波长230nm；紫外检测器；流速1mL/min。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 甲醇体积分数对提取率的影响

由图1可知，橄榄苦苷提取率在90%甲醇溶剂处出现最大值。油橄榄叶中有很多极性不同的化合物，它们最适合的溶剂极性各不相同。因此，橄榄苦苷的提取率会随着甲醇体积分数的增加先增大后减小。

图1 甲醇体积分数对油橄榄叶中橄榄苦苷提取率的影响Fig.1 Effect of methanol concentration on the yield of oleuropein from Olea europaea leaves

图2 料液比对油橄榄叶中橄榄苦苷提取率的影响Fig.2 Effect of solid-to-solvent ratio on the yield of oleuropein from Olea europaea leaves

2.1.2 料液比对橄榄苦苷提取率的影响由图2可知，随着提取液使用量的增大，橄榄苦苷的提取率逐渐上升，当提取液使用量超过1∶25时，橄榄苦苷提取率增加甚少。因此选取料液比1∶25。

2.1.3 提取时间对橄榄苦苷提取率的影响

图3 提取时间对油橄榄叶中橄榄苦苷提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the yield of oleuropein from Olea europaea leaves

由图3可知，橄榄苦苷提取率在30min出现最大值，随着提取时间的增加，提取率呈先上升再下降，其原因可能是由于橄榄苦苷超声提取时间过长，超声波引起产物结构变化降低提取率。因此选择超声提取时间30min。

2.1.4 提取次数对橄榄苦苷提取率的影响

图4 提取次数对油橄榄叶中橄榄苦苷提取率的影响Fig.4 Effect of repeated extraction number on the yield of oleuropein from Olea europaea leaves

由图4可知，1次提取率为6.70%，2次提取率仅为0.94%，考虑到时间、成本和能耗损失，故选择提取次数为1次。

2.2 响应面分析与橄榄苦苷提取工艺的优化

选取甲醇体积分数、料液比、提取时间作为对橄榄苦苷提取率影响显著的3个因素，在单因素试验的基础上采用3因素3水平的响应面分析方法进行试验设计，试验因素与水平见表1。

表1 橄榄苦苷提取响应面分析因素与水平Table 1 Variables and their coded levels tested in response surface analysis

表2 橄榄苦苷提取响应面分析方案及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

响应面试验设计及结果见表2。其中，试验号1～12是析因试验，而13～15是中心试验，用来估计试验误差。采用Minitab 15软件，使用未编码单位对试验数据进行多元回归拟合结果见表3，其甲醇体积分数、料液比、提取时间的二次多项回归模型为Y＝7.713＋0.091X1－0.024X2＋0.125X3－0.39X12－0.2X22－0.628X32－0.382X1X2＋0.005X1X3－0.19X2X3。

表3 回归方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the fitted regression equation

由表3可看出，根据P值判断(P＜0.01时水平极显著)，方程二次项和交互项影响明显，其中二次项更为显著，一次项影响相对显著。说明响应值(提取率)的变化相对复杂，各具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。该模型的相关系数R2＝2.87724/2.92493＝98.37%，说明此模型与试验实际拟合较好，试验失拟较小，因此可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。回归系数显著性检验表明，在所各取的因素水平范围内，对油橄榄叶中橄榄苦苷的提取率影响排序为提取时间＞甲醇体积分数＞料液比。

响应面Y对于因素X1、X2、X3值构成的三维空间在二维平面上的等高线图，可直观地反映各因素之间的相互作用。Minitab 15软件处理得到响应面分析结果见图5。

图5 各两因素交互作用对橄榄苦苷提取率影响的响应面与等高线图Fig.5 Response surface and contour plots for the effects of pairwise interactions of three variables on the yield of oleuropein from Olea europaea leaves

模型的响应曲面及其等高线直观地反映了各因素对响应值的影响。从响应面的最高点可以看出，在所选的范围内存在极值，即是响应面的最高点。比较几个图可知，因素X3(提取时间)、X1(甲醇体积分数)对响应值的影响较大，表现为曲线比较陡，这与回归分析的结果吻合。单纯从橄榄苦苷提取率值的大小考虑，可以求得最适的提取条件为X1＝93.5%、X2＝1∶25、X3＝ 26min，预测橄榄苦苷的提取率为7.75%，在此条件下进行验证实验，重复3次，取平均值，提取液中橄榄苦苷的提取率为7.83%，与预测值相差1.4%。因此，基于响应曲面法所得到的优化工艺参数准确可靠。

3 结 论

本实验使用超声法从油橄榄叶中提取分离橄榄苦苷，通过单因素试验，以及3因素3水平响应面分析试验，建立了提取率与各影响因素之间的数学模型，根据此二次回归模型，确定橄榄苦苷的最佳提取工艺参数：甲醇体积分数93.5%、料液比1∶25、提取时间26min，在此工艺条件下橄榄苦苷的实际提取率可达7.83%。因此，利用响应面分析方法对油橄榄叶中橄榄苦苷的提取工艺进行优化，可获得最佳工艺参数，降低工艺操作的盲目性。

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Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction Process for Oleuropein from Olea europaea Leaves by Response Surface Analysis

YAN Shu-jun，WANG Yuan，SU Yan-hong，RAO Zai-sheng，LI Hui*
(College of Chemical Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, China)

Objective∶ To find optimal process conditions for the ultrasound-assisted extraction of oleuropein from Olea europaea leaves. Methods∶ The effects of methanol concentration, solid-to-solvent ratio and extraction time on oleuropein yield were investigated by one-factor-at-a-time design. A three-factor, three-level Box-Behnken experimental design was employed to build a second-order polynomial regression equation. The obtained regression equation was analyzed by response surface analysis to optimize the three process conditions. Results∶ The optimal process conditions were as follows∶ methanol concentration of 93.5%, solid-to-solvent ratio of 1∶25 (g/mL) and an extraction time of 26 min. Conclusion∶ Under these conditions, the oleuropein yield from Olea europaea leaves was up to 7.83%.

Olea europaea leaves；oleuropein；ultrasound-assisted extraction；response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630(2012)18-0073-04

2011-07-08

闫树军(1988—)，男，硕士研究生，研究方向为天然药物提取与分离。E-mail：ysj512780817@163.com

*通信作者：李晖(1954—)，男，教授，博士，研究方向为药学工艺学。E-mail：Lihuilab@sina.com