硝酸毛果芸香碱滴眼液中苯扎氯铵含量测定

黄志元 朱样根

（江西珍视明药业有限公司，江西 抚州 344000）

硝酸毛果芸香碱滴眼液中苯扎氯铵含量测定

黄志元 朱样根

（江西珍视明药业有限公司，江西 抚州 344000）

目的：用高效液相色谱法（HPLC）测定硝酸毛果芸香碱滴眼液中苯扎氯铵的含量。方法：色谱柱为CN（Hypersil CN，150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.03 mol/L磷酸二氢钠溶液（用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0）-乙腈（57∶43）；流速为2 mL/min；检测波长为214 nm；柱温为35℃；苯扎氯铵C12、C14、C16之间的分离度应符合规定。结果：苯扎氯铵在40～160 μg/mL内线性关系良好，Y=12.228 1 X+6.881 4（r=0.999 9，n=6），回收率为99.7%～101.9%，RSD=0.66%。结论：该法操作简便，快速、准确、灵敏度高，重复性好，可用于硝酸毛果芸香碱滴眼液中苯扎氯铵的含量测定。

高效液相色谱法；苯扎氯铵；硝酸毛果芸香碱滴眼液；含量测定

青光眼是全球第二大致盲眼病，是不可逆盲最主要的原因，同时也是我国第二大眼科常见疾病。其治疗药物大致分为前列素类药物、β肾上腺素受体拮抗药、肾上腺素受体激动剂、碳酸酐酶抑制剂及缩瞳剂[1]。具有明显缩瞳作用的硝酸毛果芸香碱（匹罗卡品）用于治疗青光眼，由于其疗效确切，使用至今已有上百年历史[2]。我公司生产的硝酸毛果芸香碱滴眼液规格为5 mL∶25 mg，属于多剂量制剂。制剂一旦开封后，容易在使用和保存过程中被泪液和空气中的微生物污染，从而产生安全性隐患。为了防止硝酸毛果芸香碱滴眼液在使用或储存过程中被微生物污染，本品添加了抑菌剂苯扎氯铵。但目前眼用制剂中使用的抑菌剂对眼部均有不同程度的刺激性，如使用过量还会对眼组织产生损害。例如苯扎氯铵可导致眼部炎症、过敏、纤维化和干眼症。因此，抑菌剂的合理使用和质量控制是保证眼用制剂安全性、有效性的关键问题之一。在筛选抑菌剂用量时应尽量采用抑菌剂的最低有效浓度，保证药品在使用过程及有效期内符合卫生学要求，同时，最大限度地降低抑菌剂对眼睛的刺激和损害[3]。本研究旨在建立HPLC对硝酸毛果芸香碱滴眼液中苯扎氯铵含量进行控制，并将该法订入本品质量标准中。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1100高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司），ESJ180-4型电子分析天平，7530G紫外可见分光光度计，pHS-3C型酸度计。

1.2 试药

苯扎氯铵对照品（10%，W/V）：Cat.No.1051001，USP ROCKVILLE，MD Lot.LOD209（C12∶C14∶C16= 68∶25∶5）；硝酸毛果芸香碱滴眼液（江西珍视明药业有限公司，批号：090901、060901、060902、060903）；磷酸二氢钠、氢氧化钠均为分析纯，乙腈为色谱纯，水为注射用水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

以氰基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.03 mol/L磷酸二氢钠溶液 （用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0）-乙腈（57∶43）为流动相，流速：2 mL/min，检测波长214 nm，柱温：35℃；苯扎氯铵 C12、C14、C16之间的分离度应符合规定。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密量取苯扎氯铵对照品溶液 （10%，W/V）1 mL置100 mL量瓶中加水稀释至刻度，摇匀；再精密量2 mL置25 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，制成每 1 mL含苯扎氯铵80 μg的溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 直接以样品溶液作为供试品溶液。

2.2.3 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 20 μL，注入液相色谱仪，测定，按外标法以苯扎氯铵 C12、C14和 C16（相对保留时间分别约为0.51、0.71和1.00）同系物峰面积之和计算，即得。本品含苯扎氯铵应为0.0064%～0.009 6%。

2.3 方法学研究

参考《糠酸莫米松鼻喷雾剂进口注册标准》（标准号：JX20080020）项下的苯扎氯铵含量测定方法和美国药典（USP30）[4]苯扎氯铵的测定方法进行了摸索。发现糠酸莫米松鼻喷雾剂进口注册标准项下的苯扎氯铵含量测定方法中的流动相在配制过程中存在大量析出结晶的现象，可能是有机相/水相的比例反了，通过实验调整并确定比例为有机相/水相 =43/57时，同系物的3个峰可以得到较好的分离；而 USP30的色谱条件分离不佳，3个同系物色谱峰难以得到稳定的分离。因为苯扎氯铵为同系物组成的混合物，有多个色谱峰，同时《糠酸莫米松鼻喷雾剂进口注册标准》项下的苯扎氯铵含量测定方法中未明确流速和柱温，为了利于快速分析对流速和柱温进行了优化摸索，选择了流速为2.0 mL/min，柱温为：35℃。

2.3.1 测定波长的选择 取苯扎氯铵对照品溶液于205～295 nm波长范围内扫描，结果见图1，仅有末端吸收。参照《糠酸莫米松鼻喷雾剂进口注册标准》（标准号：JX20080020）项下的苯扎氯铵含量测定方法中的波长214 nm和USP30苯扎氯铵的测定波长 254 nm；取溶剂、按处方去除苯扎氯铵配制的阴性对照溶液和对照品溶液的供试品溶液分别于214 nm和254 nm下进样，测定，记录色谱图。结果显示，溶剂和阴性对照图谱对苯扎氯铵的含量测定均没有干扰；但在254 nm处苯扎氯铵峰面积很小，只有两位数，其灵敏度（总峰面积/进样量）为28.5 mAU*S/μg；而在214 nm处的苯扎氯铵峰面积比254 nm处的大很多，达到了4位数，其灵敏度为623 mAU*S/μg，是前者的二十多倍。为了便于定量检测，减少误差，所以选择214 nm作为苯扎氯铵的测定波长。

2.3.2 计算方法的选择 根据苯扎氯铵对照品（10%，W/V）的标签说明可以知道其主要同系物组分C12、C14、C16比例依次为68%、25%、5%，因测定方法为反相色谱，因此可以确定对照品色谱图中同系物的出峰依次为同系物 C12、C14、C16，通过比较制剂中使用的苯扎氯铵原料的色谱图可以发现其主要同系物组分也是 C12、C14、C16，但是比例不一样，主要是C12，占到95%以上，C14仅0.5%，C16为4%；滴眼剂样品中因苯扎氯铵含量较低，C14色谱峰几乎检测不到。参照《糠酸莫米松鼻喷雾剂进口注册标准》（标准号：JX20080020）项下的苯扎氯铵含量测定方法中 “按外标法以苯扎氯铵C12、C14和C16同系物峰面积之和计算”的计算方法，选择采用按外标法以苯扎氯铵C12、C14和C16同系物峰面积之和计算含量，同时考虑到国内外苯扎氯铵主要同系物组分 C12、C14、C16比例不一致的问题，为了消除比例不一致带来的投料和测定的误差，在苯扎氯铵原料按《中国药典》标准检查的基础上增加以苯扎氯铵对照品（USP对照品）为对照的HPLC含量测定，即采用与该制剂一样的方法，按外标法以苯扎氯铵C12、C14和C16同系物峰面积之和计算测定原料的含量，并以HPLC测定的含量计算生产中苯扎氯铵的投料量。

2.3.3 处方成分的干扰考察

2.3.3.1 按处方量配制除苯扎氯铵外的溶液作为阴性溶液。

2.3.3.2 精密量取苯扎氯铵对照品溶液（10%，W/V）1 mL置100 mL量瓶中加水稀释至刻度，摇匀；再精密量取2 mL置25 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含苯扎氯铵80 μg的溶液作为对照品溶液。

2.3.3.3 直接以样品溶液作为供试品溶液。分别取上述3种溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果表明阴性溶液对本品苯扎氯铵含量测定无干扰。结果见图1。

图1 硝酸毛果芸香碱滴眼液中苯扎氯铵HPLC图

2.3.4 重复性试验 精密吸取按2.2测定法项下配制的对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，连续进样6针，测定其峰面积，RSD为0.17%（n=6）。精密吸取090901批样品20 μL注入液相色谱仪，连续进样6针，计算苯扎氯铵的含量，RSD为0.22%（n=6）。

2.3.5 线性试验 精密量取苯扎氯铵对照品适量，分别稀释成40、80、100、120、140、160 μg/mL的溶液，取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标进行线性回归得回归方程为：

Y=12.228 1 X+6.881 4（r=0.999 9，n=6），结果表明该法线性关系良好。

2.3.6 回收率试验

2.3.6.1 精密量取苯扎氯铵对照品溶液（Cat.No. 1051001，USP ROCKVILLE；MD Lot.LOD209；10%，W/V）1 mL置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为储备液。

2.3.6.2 精密量取储备液3 mL，置50 mL量瓶中，加阴性溶液至刻度，摇匀，作为供试品溶液，共平行配制3份。

2.3.6.3 精密量取储备液2 mL，置25 mL量瓶中，加阴性溶液至刻度，摇匀，作为供试品溶液，共平行配制3份。

2.3.6.4 精密量取储备液5 mL，置50 mL量瓶中，加阴性溶液至刻度，摇匀，作为供试品溶液，共平行配制3份。照含量测定方法进行试验，回收率结果见表1。

2.3.7 耐用性试验 按上述含量测定方法,分别改变流速为1.8和2.2 mL/min、改变流动相比例为60∶40和52∶48以及改变柱温为30℃、35℃和40℃对样品（批号：090901）进行含量测定。结果表明该方法在流动相流速、流动相比例和柱温变化方面的耐用性均较好，RSD也均符合规定。

2.3.8 相对保留时间的确定 取不同时间、不同条件下测定的苯扎氯铵 C12、C14、C16的保留时间，以C16的相对保留时间为1.00，计算各同系物的相对保留时间，结果见表2。

由表中结果可知苯扎氯铵C12、C14、C16的相对保留时间较为稳定，根据表中结果，将苯扎氯铵C12、C14、C16的相对保留时间定为约0.51、0.71和1.00。

综上所述，方法学研究结果表明，该法可以准确测定硝酸毛果芸香碱滴眼液中苯扎氯铵含量。

2.3.9 样品的含量测定及含量限度的确定 根据上述确定的方法，对长期留样36个月的3批样品和新制备的1批样品进行含量测定，结果见表3。3讨论

3.1 由表3结果可知，新制备的样品苯扎氯铵含量与投料量基本相符；但样品在储存过程中苯扎氯铵的含量有所下降，至36个月时降低约0.001 1%。苯扎氯铵为季铵类阳离子表面活性剂，是一种快速广谱杀菌剂，低浓度对各种革兰阳性和革兰阴性细菌即有杀菌作用。滴眼药防腐剂用量 0.005%～0.02%，其有效浓度为0.002%～0.001%[5]。而本品中苯扎氯铵的的含量为0.008%，长期留样36个月的3批样品中苯扎氯铵的含量仍在其有效浓度范围内，表明硝酸毛果芸香碱滴眼液使用该浓度的苯扎氯铵用作抑菌剂是可行的。

表1 含量测定的回收率测定结果

表2 苯扎氯铵C12、C14、C16相对保留时间测定结果

表3 样品含量测定结果

3.2 因各生产厂家所用抑菌剂不一定相同，所以《中国药典》（2010年版）二部项下硝酸毛果芸香碱滴眼液质量标准[6]中未列入抑菌剂检查项目。为保证产品在正常使用过程中的苯扎氯铵含量限度不低于最低抑菌有效浓度，特将苯扎氯铵含量限度检查项列入本品质量标准。相关文献资料[7]认为，国家食品药品监督管理局会结合药品审批另行颁发本品药品注册标准，该标准往往在药典标准基础上建立更为严格的质控标准，从而更好地保证药品质量。为此，我们将苯扎氯铵含量限度检查方法订入标准。结合国内外滴眼液抑菌剂80%～120%的含量限度要求和该产品实际情况，确定硝酸毛果芸香碱滴眼液的苯扎氯铵含量限度为0.006 4%～ 0.096%（g/mL）。该限度在苯扎氯铵有效浓度范围内，能保证产品质量。

3.3 由于该法分析时间较长，因此建议使用长度为150 mm的氰基柱。

[1]白洁，杨兴华，普明辉，等.贝美前列素滴眼液疗效及经济性评价研究综述[J].中国执业药师，2009，6（11）：28-31.

[2]陈祖基.实用眼科药理学[M].北京：中国科学技术出版社，1993：348.

[3]宁黎丽.眼用制剂研发过程中应关注抑菌剂的合理使用和质量控制[J].中国药学杂志，2007，42（23）：1836-1838.

[4]The United states Pharmacopeial Convention.USP 30-NF25[M]. Rockville：United states Pharmacopeial Convention，2006：1069.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典临床用药须知（化学药和生物制品卷）（2005年版）[M].人民卫生出版社，2005：854-855.

[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010年版）二部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：947.

[7]王平.药品的质量控制与质量标准 [J].中国执业药师，2008，5（7）：38-39.

Determination of Benzalkonium Chloride in Pilocarpine Nitrate Eye Drops

Huang Zhiyuan，Zhu Yanggen（Jiangxi Zhenshiming Pharmaceutical Co.，Ltd.，Jiangxi Fuzhou 344000，China）

Objective： To determine the content of benzalkonium chloride in the pilocarpine nitrate eye drops by HPLC.Methods：The chromatographic column （Hypersil CN，150 mm× 4.6 mm，5 μm）was used，the mobile phase was 0.03 mol/L sodium dihydrogen phosphate solution （plus 1 mol/L sodium hydroxide solution adjusted pH value to 7.0）-acetonitrile （57∶43），the flow rate was 2.0 mL/min，the UV detection was at 214 nm，the column temperature was 35℃，the resolutions between benzalkonium chloride C12，C14，C16conformed to the stipulation.Results：The linear calibration curves of benzalkonium chloride were obtained within the range of 40～160 μg/mL，Y=12.228 1 X +6.881 4（r=0.999 9，n=6），the recovery was 99.7%～101.9%（RSD=0.66%）.Conclusion：The method is simple，fast and accurate，with a high sensitivity and good repeatability，and can be used for the content determination of benzalkonium chloride in the pilocarpine nitrate eye drops.

HPLC；Benzalkonium Chloride；Pilocarpine Nitrate Eye Drops；Content Determination

10.3969/j.issn.1672-5433.2012.10.006

2011-12-05）

黄志元，男，工程师。研究方向：药品研发与注册。通讯作者E-mail：hzy.lxy@163.com