ARHⅠ和DAPK在人脑胶质瘤组织中的表达及意义

何瑞，袁志诚，湛利平，李巧玉

(1.江苏大学附属人民医院神经外科，江苏 镇江 212002;2.江苏大学临床医学院，江苏 镇江 212001)

胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，由于具有很强的侵袭性，且与周围脑组织没有明显的界限，目前多采用以手术为主，结合放、化疗的综合疗法，但治疗效果仍不容乐观，人们一直在探索各种新的治疗方法来抑制肿瘤细胞的侵袭与转移，从而提高治疗效果［1］。本研究采用免疫组化方法检测正常脑组织与不同临床病理分级的脑胶质瘤组织中ras同源家族成员Ⅰ(aplysia ras homologⅠ，ARHⅠ)基因和死亡相关蛋白激酶(death associated protein kinase，DAPK)基因的表达，分析两者的相关性，为临床上对胶质瘤恶性程度、临床预后及复发等方面的判断和分析提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 标本来源

47例脑胶质瘤标本均取自本院神经外科2009年6月至2011年12月手术切除标本的冰冻蜡块，其中男29例，女18例，年龄14～73岁，中位年龄38.5岁。10例正常脑组织均取自脑外伤减压术患者。所有患者术前均未接受化疗、放疗或激素治疗，所有病例均有组织病理学和(或)细胞诊断学依据。标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，严格按照WHO(2000年)胶质瘤分类标准进行病理分类、分级:Ⅰ级6例，Ⅱ级10例，Ⅲ级14例，Ⅳ级17例，全部病理切片均经两名以上有经验的病理科医师同时确诊。

1.2 主要试剂及仪器

ARHⅠ兔抗人单抗原液和SP免疫组化试剂盒均购自北京博奥森生物技术有限公司;兔抗人DAPK多抗原液购自武汉博士德公司。主要实验仪器包括光学显微镜及光学显微镜照相系统(Olympus公司)，石蜡自动包埋脱水机(金华惠友仪器设备有限公司)，微波仪、显微镜、连续切片机(Leica公司)。

1.3 免疫组化染色

每例标本取2张切片，采用SP法进行染色。严格按照试剂盒说明书操作。结果判定:随机选取5个高倍视野，每个视野计数100个细胞，ARHⅠ和DAPK的阳性染色均以细胞质和(或)细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性表达，所有细胞按阳性细胞数及染色强度分为4级。阴性(－)，随机视野中无阳性细胞;弱阳性(+)，阳性细胞数少于30%，着浅棕黄色;中度阳性(++)，阳性细胞数30% ～80%，着棕黄色;强阳性(+++)，阳性细胞数＞80%，着棕黑色。

1.4 统计学方法

应用SPSS 16.0统计软件进行分析，ARHⅠ和DAPK蛋白在各级别胶质瘤中的阳性表达率比较均采用χ2检验，两者间的相关性分析采用Spearman秩相关分析。以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人脑胶质瘤中ARHⅠ蛋白的表达

免疫组化结果显示，ARHⅠ蛋白在正常脑组织中呈强阳性表达，而在不同级别胶质瘤组织中随着肿瘤分化级别的降低和恶性程度的增高ARHⅠ的表达相应降低。ARHⅠ蛋白的阳性表达主要表现为细胞膜和细胞质呈不同程度的着色。见图1。经χ2检验分析提示，随着脑胶质瘤恶性程度的增高，ARHⅠ蛋白的阳性表达率相应降低，见表1。ARHⅠ在Ⅰ－Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级脑胶质瘤之间的表达，差异有统计学意义(P ＜0.05)。

图1 ARHⅠ蛋白和DAPK蛋白在Ⅱ级、Ⅲ级胶质瘤组织中的表达(SP×200)Fig 1 Expression of ARHⅠ and DAPK in glioma of grade II and grade III(SP×200)

表1 正常脑组织和各级别脑胶质瘤中ARHⅠ的表达Tab 1 Expression of ARHⅠin normal brain and glioma of all pathological grades

2.2 人脑胶质瘤中DAPK蛋白的表达

免疫组化结果显示，DAPK蛋白在正常脑组织中呈强阳性表达，而在不同级别胶质瘤组织中随着肿瘤分化级别的降低和恶性程度的增高DAPK的表达相应降低。DAPK蛋白的阳性表达主要表现为细胞膜和细胞质呈不同程度的着色，见图1。经χ2检验分析提示，随着脑胶质瘤恶性程度的增高，DAPK蛋白的阳性表达率相应降低，见表2。DAPK在Ⅰ～Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级脑胶质瘤之间的表达，差异有统计学意义(P ＜0.05)。

表2 正常脑组织和各级别脑胶质瘤中DAPK的表达Tab 2 Expression of DAPK in normal brain and glioma of all pathological grades

2.3 ARHⅠ和DAPK在人脑胶质瘤组织中表达的相关性

经Spearman秩相关分析证实，在47例脑胶质瘤组织中，ARHⅠ有DAPK蛋白的阳性表达率之间呈显著正相关(r=0.723，P ＜0.05)，即ARHⅠ表达越高，DAPK的表达也随之增加。见表3。

表3 ARHⅠ和DAPK在胶质瘤组织表达的相关性例Tab 3 Relationship between the expressions of ARHⅠ and DAPK proteins in glioma tissues

3 讨论

近年来的研究表明，在多种人类肿瘤中均存在自噬活性的改变，自噬作用是肿瘤细胞的一种适应性反应，对肿瘤细胞起保护作用，自噬活性的降低在乳腺癌和胃癌的发生、发展中发挥作用［2－3］。研究已证实肿瘤的发生发展是一个多基因的复杂演变过程。其中有两类基因与肿瘤的发生、发展密切相关，一类是癌基因，另一类是抑癌基因。ARHⅠ是1999年由美国德克萨斯大学采用差异展示PCR(differential display PCR)发现的第一个ras家族中被报道的抑癌基因，又名NOEY2或ras同源基因家族成员I。Xu等［4］将人的ARHⅠ基因导入 FVB/B鼠体内，证实ARHⅠ在肾脏、肌肉、肺、脑、心脏均有表达。研究证实卵巢癌中存在 ARHⅠ的低表达［5］。Bao等［6］发现感染含ARHⅠ基因的腺病毒载体的肿瘤细胞株，5天后30% ～45%的乳腺癌和5% ～11%的卵巢癌细胞发生了凋亡。另外，有报道前列腺癌中存在广泛的1p31缺失，而ARHⅠ基因正位于该区域［7］。上述研究结果表明，ARHⅠ是抑癌基因，它的缺失可能引起肿瘤的发生。本研究结果显示，ARHⅠ在正常脑组织中均有表达，在脑胶质瘤组织中的阳性表达率逐渐下降，与乳腺癌、卵巢癌组织中的表达情况类似。随着脑胶质瘤恶性程度的上升，ARHⅠ的表达逐渐降低甚至出现阴性表达，提示ARHⅠ的表达缺失可能促进脑胶质瘤的发生、发展。

DAPK基因的蛋白产物是一个相对分子质量为160×103的Ca2+/CaM调节的苏/丝氨酸激酶，能通过 TNF-α，Fas、IFN-γ 等路径诱导细胞的凋亡，并在肿瘤抑制中发挥关键性的作用。研究表明，DAPK在宫颈癌和原发性中枢神经系统淋巴瘤组织中出现表达的缺失［8－9］。胡礼炳等［10］发现正常膀胱黏膜上皮的DAPK基因的免疫组化染色呈强阳性，在膀胱癌组织中大多为阴性，少数为弱阳性染色。杨海艳等［11］发现DAPK在高分化子宫内膜癌组织中的表达明显高于低分化子宫内膜癌。本研究结果表明，DAPK蛋白在正常脑组织中均有表达，在脑胶质瘤组织中的阳性表达率逐渐下降甚至出现缺失，与宫颈癌、子宫内膜癌、肺癌及膀胱癌组织中的表达情况类似。这说明在脑胶质瘤的发生、发展中DAPK也发挥了一定的作用。同时本研究表明，随着脑胶质瘤恶性程度的上升，DAPK的表达逐渐降低甚至出现阴性表达，提示DAPK的表达缺失，可能也促进了脑胶质瘤的发生、发展。

DAPK在自噬中发挥核心作用，当微管相关蛋白1B(microtubule associated protein 1B，MAP1B)与DAPK结合为DAPK-MAP1B时，可介导膜泡和自噬小体的形成，激发自噬［12－13］，ARHⅠ通过上调自噬相关基因4，促进绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)-LC3-I裂解为自噬小体膜上的GFPLC3-II，直接参与LC3-II在自噬膜的定位与自噬小体的形成［14］。此外，两者在自噬活性的调节中也相互协同［15］。DAPK可能发挥了自噬活动的门控作用，既为ARHⅠ作用的发挥创造了条件又控制了自噬的启动。因此，ARHⅠ与DAPK共同参与自噬活性的调节与自噬小体的形成。本研究结果显示，ARHⅠ和DAPK的表达水平均与胶质瘤的分化程度有关，随着胶质瘤恶性程度的增高，两者表达水平均呈降低的趋势，并且两者呈正相关。提示ARHⅠ和DAPK在脑胶质瘤的发生、发展中可能起协同作用。其表达强弱可反映胶质瘤的恶性程度。因此，同时检测两者的表达，有助于进一步了解胶质瘤的生物学特点，为临床工作中对胶质瘤的形成模式、恶性程度、临床预后及复发等方面的判断和分析提供一种新思路，并有望作为判断胶质瘤预后情况的生物学标志物。

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