犬白细胞介素18基因的克隆与序列分析

侯 静，古 锋，徐志文，朱 玲.2＊

（1.四川农业大学动物医学院，四川雅安 625014；2.动物生物技术中心四川省重点实验室，四川雅安 625014）

白细胞介素（interleukins，IL）是由活化的单核巨噬细胞或淋巴细胞产生的一类主要负责信号传递，联络白细胞群，调节细胞的活化、增殖和分化作用的细胞因子。白细胞介素18（IL－18）属于IL－1细胞因子家族成员，为近年发现的一种分布广泛的细胞因子，是一种重要的免疫调节因子，具有多种生物学功能。1989年Nakamura等从内毒素休克的小鼠血清中分离出一种与IL－2功能上有相似之处的蛋白因子，该因子可诱导静息脾非黏附细胞产生高水平IFN－γ。1995年Okamnra H等从先经热灭活的痤疮丙酸杆菌接种后经脂多糖攻击引起中毒性休克的小鼠肝脏中克隆出该因子，因其可诱导T细胞产生IFN－γ，故命名为IFN－γ诱导因子（interferonγ－inducing factor，IGIF）［1－3］。1995年又获得了人IGIF的cDNA克隆，并在大肠埃希菌中成功表达，于1996年才正式命名为白细胞介素18（interleukin 18，IL－18）。T、B细胞几乎没有IL－18mRNA的表达，主要由巨噬细胞产生。IL－18在清除细胞内细菌、病毒、真菌、原核生物［4］等方面起着特别有效的作用，在抗微生物感染、抗自身免疫疾病、抗肿瘤免疫中具有很大应用潜力［5－7］。IL－18也被公认为一种可以替代传统疗法的新型治疗剂和有效的免疫佐剂［8］。

近年来，国内对人、鼠、猪，、鸡、毛皮动物［9－11］等IL－18基因克隆及相关研究均有报道。曹殿军等［12］用犬脾细胞刺激诱导提取核酸的方法克隆IL－18基因。本研究通过对犬外周血白细胞刺激诱导后，采用RT－PCR技术克隆犬IL－18基因，并对其序列进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料

试验犬由四川农业大学动物医院提供的健康成年家犬。RNA抽提试剂盒购至Promega公司；Con A、反转录酶、Taq酶、RT－PCR试剂盒、BamHⅠ、EcoRⅠ、白细胞分离液、Marker DL 2 000、胶回收试剂盒、pMD19－T simple vector、质粒抽提试剂盒，均购至宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取 无菌采取犬外周血，肝素抗凝，用白细胞分离液分离外周血白细胞，经Con A刺激诱导，收集白细胞。用RNA抽提试剂盒提取总RNA，操作方法严格按试剂盒说明书进行。电泳观察RNA的完整性，并加RNA抑制酶于－70℃保存备用。

1.2.2 引物设计 根据GenBank上登录的犬IL－18序列（Y11133），用Oligo软件设计1对引物，并在两侧加酶切位点BamHI和EcoRI，加上保护碱基。引物设计序列如下：P1：5′－GGATCCATGGCTGCTAACCTAACCTAATAGAAGAC －3′；P2：5′－GAAT－TC CTAGCTCTTGTTTTGAACAGTGAAC－3′（划线部分为酶切位点），该引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.2.3 犬IL－18基因的克隆 10μL体系反转录：1μLRNA，上下游引物各0.5μL，84℃5min后冰浴5min，然后加RNA酶抑制剂及反转录酶各1μL，42℃水浴1h。10μL体系PCR：1μL RT产物，上下游引物各1μL，PCR Mix 5μL，ddH2O 3μL。反应程序如下：95℃5min；95℃45s；54℃30s；72℃45s，35个循环；72℃8min。

1.2.4 重组质粒构建 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，回收580bp处的DNA片段，与PMD19－T simple vector连接。将重组质粒转化到DH5α感受态细胞中，涂布Amp＋平板筛选。挑取单菌落，接种到LB中，37℃下摇床培养12h，抽取质粒。通过BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定后，将阳性重组质粒送至宝生物工程（大连）有限公司测序。DNA Star软件对测序结果进行分析。

2 结果

2.1 重组质粒双酶切及PCR鉴定

将重组质粒进行BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切及PCR鉴定，得到与目的基因大小一致的特异性片段，说明所克隆的目的基因已成功插入pMD19－T simple vector，初步确定成功克隆了犬IL－18基因（图1）

图1 重组质粒双酶切鉴定Fig.1 Double enzyme digestion analysis of recombinant canine IL－18

2.2 犬IL－18碱基测序及相关分析

测序结果与GenBank上的犬IL－18基因序列完全一致，全长为 582bp。狐（EF581889）、貉（EU200969）、羊（AJ401033）、牛（NM＿174091）的IL－18阅读框均为582bp，结果显示氨基酸同源性为96.4%、91.2%、81.4%、79.9%。猫（DQ100372）、兔（EU419127）和猪（NM＿213997）则缺失1个氨基酸，鼠（NM＿019165）增加1个氨基酸，其同源性分别为82.9%、67.9%、83.9%、59.3%。犬与貉、狐的同源性最高，与羊、猪、牛、猫同源性也较高（表1）。由DNA Star软件分析得到IL－18氨基酸进化树可见犬与貉、狐的亲缘关系最近（图2）。

表1 犬和其他动物IL－18氨基酸序列同源性比较Table 1Comparison amino acid sequence homology of canine IL－18and other animal IL－18

图2 犬IL－18基因氨基酸序列分子进化树分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of canine IL－18amino acid sequence

3 讨论

犬作为伴侣动物，在我国的养殖范围不断扩展，病毒病对养犬业影响甚大，病毒破坏了犬的免疫系统，出现发热发炎等症。而IL－18具有免疫调节的功能，能激活免疫系统，维持机体的稳定性［3］。犬IL－18是一种重要的细胞因子，能诱导NK细胞、T细胞及巨噬细胞产生IFN－γ，还能促进T细胞增殖，诱导NK细胞杀伤和Th1细胞的细胞毒活性［14］，具有抗肿瘤及抗病毒等作用［15－16］，因而可成为核酸疫苗的重要免疫佐剂［17－18］。使其在多态性药物的开发，疾病的预防与治疗等方面具有很大的潜在运用价值，值得做进一步的研究。

Con A具有调节机体免疫反应，增强白细胞的表达活性，因此本试验从外周血分离白细胞，Con A刺激培养18h，并成功克隆犬IL－18，得到碱基序列为582bp。通过DNA Star分别就犬IL－18与其他哺乳动物进行同源性分析，与Okano F等［19］从犬肺巨噬细胞中扩增的IL－18碱基序列一致。通过犬与其他动物的氨基酸序列同源性比较，结果显示其进化关系与基因水平一致，犬IL－18与同属犬科动物的狐和貉同源性最高，与其他动物则存在较大种属差异。本试验为犬IL－18的表达及其活性、生物学功能研究提供了材料。

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