人自体血清支持脐血源HSCs和MSCs共培养研究

宋 克 东， 刘 天 庆＊， 殷 轶 群， 郭 文 华， 方 美 云，石 芳 鑫， 朱 丽 丽， 吴 筱 婷， 马 学 虎， 崔 占 峰

（1.大连理工大学 化工学院 干细胞与组织工程研发中心，辽宁 大连 116024；2.大连医科大学 附属第一医院 血液科，辽宁 大连 116011；3.大连医科大学 附属第一医院 妇产科，辽宁 大连 116011；4.牛津大学 工程科学系 组织工程与生物处理中心，英国 牛津 OX1 3PJ）

0 引 言

对造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）的不断研究证明，其可以广泛应用在基因治疗、骨髓移植及肿瘤净化等方面[1]，特别是HSCs移植可应用在癌症患者放化疗后的造血功能重建中.但是HSCs在临床上却没有得到广泛应用，原因之一就是干细胞数量有限[2，3]，对其进行体外规模化扩增是解决此问题的有效方法.另外，虽然HSCs移植对癌症患者放化疗后的生命质量有显著的改善作用，但由此因短期内严重嗜中性粒细胞减少症和血小板减少症等所带来的痛苦却是绝大多数患者不可避免要承受的，因此改善细胞质量，降低这些并发症的发生是十分必要的.

目前，已有研究证明了间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有体外支持造血发生的功能，同时在NOD/SCID小鼠的体内实验中，也证明了在同时移植HSCs和MSCs的情况下，对小鼠造血功能的重建有加速作用[4].而且联合移植自体的MSCs对于临床乳腺癌患者在化疗后进行的造血干细胞移植，同样具有促进造血重建的作用，与此同时，还有助于降低伴随HSCs移植而引起的并发症的发病率.除此之外，MSCs也可作为细胞治疗的种子细胞和基因治疗的载体细胞.

HSCs可来源于脐带血（umbilical cord blood，UCB）、骨髓及外周血等，相对于后两者，来源于UCB的HSCs不仅富含更早期的造血干/祖细胞，同时具有采集和保存容易、免疫原性弱、对异源性抗原产生的抗体少、无肿瘤细胞污染、对供者无损伤及副作用、成熟性T细胞较少、CD34＋CD38－与CD34＋CD33－的比例较高、来源广泛且移植过程中可以降低移植物抗宿主病（GVHD）发生率等诸多优点[5].另外，UCB中还含有MSCs，这就使得与脐带血有关的干/祖细胞成为了研究的热点.在同一个培养体系内使UCB中的HSCs和MSCs能够同时培养与收获，来发挥脐血库所保存的脐带血干细胞资源应用于临床中的作用，由此带来的深远影响是毫无疑问的.

目前对于脐带血来源的HSCs与MSCs共培养的研究报道尚少[5].本实验室范秀波等，在不添加血清，只添加了细胞因子组合（SCF 15ng·mL－1，TPO 6ng·mL－1，G－CSF 1ng·mL－1，FL 5 ng·mL－1，GM－CSF 5ng· mL－1，IL－3 15 ng·mL－1），同时用AC胶珠包被基质细胞支持的条件下，将微载体与生物反应器相结合，对UCB－HSCs与UCB－MSCs在转瓶及旋转壁式生物 反 应 器 （rotating wall vessel bioreactor，RWVB）内的共培养进行了考察[6].实验结果表明，在RWVB中的扩增效果是最优的，12d内CFU－Cs扩增了（5.1±1.2）倍；NCs扩增了（3.7±0.3）倍；CD34－CD45－CD105＋（MSCs）细胞扩增了 （13.9±1.2）倍；CD34＋CD45＋CD105－（HSCs）细胞扩增了（5.2±0.4）倍.另外，对骨髓来源的HSCs与MSCs的共培养研究也已处于起步阶段.Chen等用培养基MeylocultTM，不添加血清，加入高剂量的细胞因子组合（SCF 50 ng·mL－1，IL－3 10ng · mL－1，IL－6 10 ng·mL－1），在RWVB内令骨髓来源的HSCs和MSCs分别成功扩增了8倍和29倍[7].但是，由于Chen等对HSCs与MSCs的共培养采用的是悬浮方式，在分离收获HSCs与MSCs时存在一定的难度.此外，到目前尚未有采用脐带血自体血清同时培养和收获脐带血中两种干细胞方面的研究报道.

由于HSCs悬浮生长，而MSCs具有贴壁生长的生物学特性，要想模拟体内微环境实现HSCs和MSCs的共培养，必须兼顾两者的生长特性，分别提供它们悬浮培养环境与动态贴附表面，将微载体与适宜的生物反应器结合是解决此问题的可行方法之一.因变性胶原包被的交联葡聚糖（cytodex－3）微载体具有良好的表面贴附特性，在三维动态培养贴壁细胞方面受到了广泛关注.另外，与应用普遍的胎牛血清（FBS）相比，使用同一份脐带血中的自体血清不仅可以为细胞提供更好的营养物质，而且在收获细胞后的临床应用中，也可以避免胎牛血清等动物血清引起的免疫反应.

本研究使用同一份脐带血的血清，不添加细胞因子，也无基质细胞支持，采用微载体技术，实现脐带血来源造血干细胞（UCB－HSCs）与间充质干细胞（UCB－MSCs）的共培养，并实现培养后两种细胞的分离.继而考察人自体血清在不同含量（2.8%、5.6%、8.3%和11.1%）下对 UCB－HSCs和UCB－MSCs体外扩增的影响，同时将5%、10%、15%和20%的FBS作为参照，来确定血清的较优用量.

1 实验材料和方法

1.1 实验试剂及药品

IMDM培养基和胎牛血清（FBS）购自美国Gibco；脐血源血清和PBS缓冲盐溶液自配；人淋巴细胞分离液（Ficoll－Paque）购自瑞典Amersham Biosciences公司；DMEM （高糖）、地塞米松（Dexamethasone）、IBMX、β－甘油磷酸钠、吲哚美辛、胰岛素、维生素C、运铁蛋白和亚油酸均购自美国Sigma；青霉素钠和硫酸链霉素购自大连美罗大药厂；CCK－8试剂盒购自日本同仁化学研究所；FITC－抗人CD34、IL－3和 GM－CSF购自美国BD Biosciences公司.

1.2 UCB－MNCs的分离

人脐带血采自大连市沙河口区妇幼保健院，使用前已经得到产妇及家人知情同意.脐带血均取自健康产妇足月分娩或足月剖宫产的婴儿，每次采集量为50～100mL.在15mL无菌离心管内加入密度为1.077g·mL－1的人淋巴细胞分离液4mL，用吸管轻轻地将脐带血稀释液（脐带血与PBS缓冲盐溶液按体积比1∶1混合稀释）滴加到人淋巴细胞分离液液面上（人淋巴细胞分离液与脐带血稀释液的比例为1∶（1～2）），以2 500r/min离心25min.待离心结束，用吸管将中间白膜层吸取，获得 UCB－MNCs（单个核细胞）.分离后的细胞用IMDM基础培养基离心洗涤两次（1 000r/min，5min），调整细胞密度备用.

1.3 脐血源血清的提取

脐血源血清的提取方法：将全血室温下静置1～2h后，离心（1 000r/min，15min），离心后上清即为血清，取上清于－20℃保存备用.这种方法的弊端是需要将脐带血分成两份，来分别提取血清和单个核细胞，而每份脐带血50～100mL，所含单个核细胞为1×108cell左右，如果将其分成两份一定会减少原代获取的细胞数量，结果在一定程度上造成了宝贵的干细胞资源的浪费.有的学者[7]采用以下方法同时获得了血清和单个核细胞：将离心取完血清后的沉淀物与培养基混合，然后使用甲基纤维素沉淀红细胞，接着去上清离心再与淋巴细胞分离液混合，采用密度梯度离心获取单个核细胞.采用这种方法，血清和单个核细胞虽然能同时获得，但是过程中需要多次离心，并且从取得脐带血到分离出单个核细胞的过程耗时过长，这些都会对原代细胞的质量产生一定的影响.

1.4 cytodex－3微载体的预处理

称取100mg（干质量）cytodex－3微载体分别置于两支15mL无菌离心管中，然后加入10mL新鲜的不含Ca2＋、Mg2＋的PBS缓冲盐溶液，于37℃环境中孵育过夜.隔天弃去上清，用新鲜的PBS缓冲盐溶液（不含Ca2＋、Mg2＋离子）冲洗两次，再加入10mL PBS缓冲盐溶液，于115℃、1×105Pa下高压灭菌15min.灭菌后，在超净台内操作，先吸去上清，用IMDM培养基清洗两次，随后加入10mL IMDM培养基，置于4℃冰箱中备用.

1.5 细胞计数

使用细胞计数板（即血细胞计数板）计数接种前后细胞悬液中的细胞数量和细胞密度.

1.6 静态培养

共采集7份脐带血，分别提取人自体血清和单个核细胞，前6份接种培养条件如下.人自体血清培养：将从新鲜的脐带血分离得到的UCBMNCs以2×106cells·mL－1的密度接种到24孔板（已提前铺满cytodex－3微载体）中，添加20%的同一份脐带血来源的血清，于37℃、5%CO2、20%O2及饱和湿度条件下共培养12d.通过光镜观察，每隔24h计数.另将胎牛血清培养作为对照组，培养方法为将自脐带血分离得到的UCB－MNCs按上述相同条件接种，在IMDM培养基中添加20%的FBS，作为对照组.

第7份接种方法如下：将自脐带血分离得到的MNCs以2×106cells·mL－1的密度接种到已预先铺满cytodex－3微载体的96孔板中.实验分8组进行，人自体血清（HAS）含量依次为5%、10%、15%和20%，FBS含量分别为5%、10%、15%和20%.每组均用10个孔，每孔100μL.每组实验有3个平行组.每天取各组1个孔内的微载体，使用CCK－8试剂盒测定各微载体上细胞的活力值，并用细胞计数板测定该孔内细胞悬液的细胞密度.隔天为每孔补充10μL相应的培养基.取第3、6d的细胞悬液做CD34＋细胞流式检测，并取第6d的微载体，来诱导分化成骨及成脂.

因为本研究提取的同一份脐带血的血清是采用密度梯度离心后获得的上层血清，而事先加入的PBS、抗凝剂等已将此血清成分稀释，所以人自体血清的含量实际要偏低.通过换算得出培养基中的人自体血清的实际含量依次为2.8%、5.6%、8.3%和11.1%.

1.7 CD34＋细胞的流式细胞仪分析

对扩增前后的细胞通过流式细胞仪（Becton Dickinson）进行CD34－FITC抗体检测，分别检测原代、第3d、第6d的CD34＋细胞含量.细胞标记方法如下：首先用PBS缓冲盐溶液洗涤细胞1次，然后加入10mL的CD34－FITC抗体，于4℃下避光孵育30min.孵育结束后再用PBS缓冲盐溶液洗涤1次，通过流式细胞仪分析CD34＋细胞的含量，用Mac OS 8.6软件得出检测结果.

1.8 CCK－8试剂盒测定细胞活性

选用CCK－8细胞活性试剂盒测定微载体上的UCB－MSCs细胞活性.每天小心吸出96孔板中对应孔的细胞悬液，用PBS缓冲盐溶液冲洗孔底微载体，然后轻轻吹打，等到微载体沉降到孔板底部后，用移液器小心将上清吸出.如此重复2～3次后，加入100μL新鲜的IMDM培养基，再加入10μL CCK－8试剂，于37℃下孵育3h，吸出上清，用酶标仪检测吸光度（OD）.

1.9 UCB－MSCs的多向诱导分化

将已培养6d的UCB－MSCs进行多向诱导分化检测.其方法如下：小心将原培养基吸出，保留原孔内的微载体，用PBS缓冲盐溶液冲洗1遍，等到微载体沉降后小心将PBS吸出，分别加入成骨和成脂诱导剂.在此过程中，每隔3d全量换液1次，连续诱导2周.在第1周进行成骨细胞的ALP染色，第2周进行脂肪细胞的油红染色，第3周进行成骨细胞的von Kossa染色.成骨诱导剂：DMEM＋10%FBS＋100nmol·L－1地塞米松＋50μmol·L－1维生素C＋10mmol·L－1β－甘油磷酸钠.软骨诱导剂：IMDM＋0.1μmol·L－1地塞米松＋50μg·mL－1维生素C＋100μg·mL－1丙 酮 酸 钠 ＋10ng· mL－1TFG－β3＋500 ng·mL－1BMP－6＋50mg·mL－1ITS.成脂诱导剂：DMEM＋10%FBS＋100nmol·L－1地塞米松＋200μmol·L－1吲哚美辛＋0.5mmol·L－1IBMX＋10μg·mL－1胰岛素.成骨诱导ALP染色和von Kossa染色方法参见文献[8，9].

1.10 数据的统计分析

实验均选3次平行组，其中统计数据用“平均值±标准偏差”表示，采用t－检验来确定显著性水平，用Origin7.5软件进行处理.

2 实验结果

2.1 原代UCB－MSCs的培养成功率

本研究共采集了7份脐带血，其中有5份人自体血清培养组成功培养出UCB－MSCs，成功率约为71.4%.胎牛血清培养组中也有相同的5份成功培养出UCB－MSCs.而另两份均未培养出UCB－MSCs，原因可能是其中一份脐带血是过夜（24h）后操作的，细胞质量可能因此受到了一定的影响.

通过考察细胞在微载体上的贴附及生长状态可以看出，同一份脐带血来源的人自体血清（HAS），对 UCB－HSCs和 UCB－MSCs的体外扩增有很好的支持效果，由图1（a）可以看出 UCBMSCs在cytodex－3微载体上的贴附生长状态良好.

与20%FBS的培养效果（图1（b））相比较，同一份脐带血来源的人自体血清可以达到与之相同的培养效果.这说明11.1%含量的脐带血人自体血清可以替代20%的FBS，在培养过程中支持UCB－MSCs在cytodex－3微载体上的贴附、伸展和生长.

在培养前6份脐带血干细胞的过程中，采用计数板每24h统计悬液中的有核细胞（NCs）数，其密度变化如图1（c）所示.由图可以看出含量为11.1%HAS培养组和20%FBS培养组的密度变化情况基本是一致的，且11.1%HAS在120h时达到密度的最大值4.5×106cells·mL－1，而20%FBS在72h达到最大值3.5×106cells·mL－1，达到最大值后进入平台期48h.二者无显著性差异（p＜0.05）.

2.2 原代UCB－HSCs的CD34＋流式结果

原代细胞的CD34＋流式结果如图2所示.其中实验组的结果为加入CD34抗体的检测结果，得出阳性率为1.1%；而空白对照组的结果为未加CD34抗体处理的检测结果，得出阳性率为0.4%.两图阳性率之差即为原代细胞中的CD34＋细胞（UCB－HSCs）含量，约为0.7%.每份脐带血原代共分离得到单个核细胞5.28×107cells，其中UCB－HSCs的含量为3.7×105cells.

2.3 UCB－MSCs在微载体上的贴附

培养10d后，在cytodex－3微载体上的UCBMSCs贴附形态如图3所示.其中图3（a）～3（d）为人自体血清培养组，血清含量逐渐递增，分别为2.8%、5.6%、8.3%和11.1%.图3（e）～（h）为作为对照的胎牛血清培养组，血清含量分别为5%、10%、15%和20%.从图中可以看出，在8组实验组中均有间充质样细胞在cytodex－3微载体表面贴附，且伸展状态良好.但在这8组中，微载体表面的细胞数量均略有不同，在HAS及FBS培养组中，随着血清含量的增加，微载体表面的细胞数量都略有增加.

2.4 总有核细胞（NCs）的扩增

在培养条件为加入不同含量血清，同时隔天补液10μL的情况下，96孔板内悬液中的细胞密度变化如图4（a）、（b）所示.从图4（a）可以看出，当在培养基中添加HAS时，4组血清浓度不同时，对细胞密度变化带来的影响并不大，只是随着血清浓度的增加，细胞密度略有增加.各组细胞密度均在第4d达到最大值，分别为（2.9±0.1）×106、（3.2±0.25）×106、（3.5±0.4）×106和（3.9±0.1）×106cells·mL－1.由图4（c）可以看出在培养的第4d，2.8%组 NCs扩增了（1.45±0.05）倍，5.6%组 NCs扩增了（1.58±0.13）倍，8.3%组 NCs扩增了（1.73±0.2）倍，11.1%组 NCs扩增了（1.95±0.05）倍.

图1 含血清培养体系中UCB－MSCs在cytodex－3微载体上的贴附和NCs细胞密度变化情况Fig.1 UCB－MSCs adhered to cytodex－3microcarriers and change of density of NCs cultured with serum

图2 原代UCB－HSCs的流式分析结果Fig.2 Flow cytometric analysis of primary UCB derived HSCs

图3 UCB－MSCs在cytodex－3微载体上的贴附形态Fig.3 UCB－MSCs adhered to cytodex－3microcarriers

图4 不同血清条件下的NCs细胞密度变化和扩增倍数Fig.4 Density change of NCs and expansion fold of NCs cultured with different serum content

从图4（b）中可以看出，在培养基中加入FBS时，其含量对于NCs的密度变化影响也不是很大，4组同样均在第4d达到细胞密度最大值，依次为（3.6±0.53）×106、（4.0±0.25）×106、（3.7±0.17）×106和（3.97±0.2）×106cells·mL－1.但与 HAS组不同的是，细胞密度在FBS的含量为10%时最大，培养效果最好.由图4（d）可以看出培养至第4d时，5%组NCs扩增了（1.8±0.26）倍，10%组 NCs扩增了（2.0±0.13）倍，15%组 NCs扩增了（1.85±0.08）倍，20%组NCs扩增了（1.98±0.1）倍.

比较两种血清培养组中效果最好的细胞密度变化，也就是将11.1%HAS组和10%FBS组作对比，如图5所示.可以看出10%FBS的细胞密度略高于11.1%HAS的，但两者并无显著性差异（p＜0.05）.

图5 NCs的细胞密度变化曲线Fig.5 Change of the cell density of NCs

2.5 UCB－HSCs（CD34＋）的扩增

通过对原代、第3d及第6d细胞悬液中的有核细胞进行CD34＋细胞（HSCs）的流式分析，即可获得血清在不同含量下的CD34＋细胞（HSCs）的扩增结果，如图6所示.从图6（a）中可以看出，HAS含量为5.6%时，对UCB－HSCs的扩增是最优的，且随着培养时间的延长，CD34＋细胞（HSCs）的含量逐渐上升，最大扩增倍数为（1.88±0.33）倍.相比原代培养，其他组的CD34＋细胞（HSCs）的含量有所下降.从图6（b）中可以看出，在FBS含量为10%时，培养效果最佳.但是，与HAS培养组不同的是，随着培养时间的延长，此组的CD34＋细胞（HSCs）的含量先增加后下降，最大扩增倍数为（4.48±0.9）倍.

同样比较了5.6%HAS和10%FBS培养下的CD34＋细胞（HSCs）扩增倍数，如图6（c）所示.由图可以看出相比5.6%HAS，在10%FBS时的培养效果更好.

2.6 微载体上UCB－MSCs活性分析

在血清含量不同的培养条件下微载体贴附UCB－MSCs的活性变化如图7所示.图7（a）、（b）添加的血清分别为人自体血清和胎牛血清.从图7（a）可以看出，采用人自体血清培养时，各组的OD相差不大，11.1%组的OD比其他组的略高，但没有显著性差异（p＜0.05）.其中当HAS含量为11.1%且培养至第3d时OD最大，为0.56±0.07，当HAS含量为8.3%时，第7dOD最大，其余两组在第4d达到最大值.从图7（b）中可看出，用FBS培养的各组的OD相差也不大，20%含量的FBS培养组的值要略高于其他组，但也无显著性差异（p＜0.05）.对于FBS培养组，随着培养时间的延长，第4d达到最大值0.5±0.01.而其余3组培养都在第7d达到最大值，分别为0.48±0.04（5%）、0.53±0.07（15%）和0.6±0.1（20%）.

11.1%HAS与20%FBS组的OD变化情况比较如图8所示.由图可看出相比HAS组，FBS培养组的OD略高.将两组OD的最大值进行t－检验，二者无显著性差异（p＜0.05），如图8（b）所示.

图6 不同血清含量下的UCB－HSCs（CD34＋）的扩增情况Fig.6 Expansions of UCB derived HSCs（CD34＋）cultured with different serum content

图7 不同血清含量培养条件下微载体上UCB－MSCs的活性变化情况Fig.7 ODof UCB－MSCs adhered to microcarrier cultured with different ontent serum

图8 微载体上UCB－MSCs的OD比较Fig.8 Comparison of ODof UCB－MSCs adheredto microcarrier

2.7 贴附在cytodex－3微载体上细胞的多向分化潜能分析

UCB－MSCs应该具有向成骨、软骨及脂肪细胞等多向分化的潜能，其中向软骨方向的诱导需要大量间充质样细胞.因为本研究自脐带血分离得到的是原代UCB－MSCs，具有较少的细胞数量，所以没有充足数量的细胞进行向软骨方向诱导的研究.比较所有培养组中贴附于微载体的细胞诱导分化情况，结果发现它们之间的诱导分化无显著性差异.

当成骨诱导1周时，进行了ALP染色，结果发现胞质内有黑褐色颗粒出现，培养细胞的诱导分化结果如图9所示，这表明微载体上有细胞表达ALP.脂肪诱导2周时，进行了油红染色，结果发现染色后各培养组中均未观察到油滴的出现.对于UCB－MSCs是否有分化成脂肪细胞的能力说法不一，Kern等[10]作了相关方面研究，结果发现UCB－MSCs不能转化成脂肪细胞.其将骨髓、脐带血及脂肪来源的间充质干细胞向成骨、软骨及脂肪等方向的分化潜能作了比较，实验中11份脐血源间充质干细胞均未能表现出向脂肪方向的分化潜能.Kern等认为，间充质干细胞转化成脂肪细胞能力与干细胞的老化程度有一定关系，脂肪细胞一般是存在于成人的骨髓和脂肪组织中的，在胎儿的骨髓中未能发现脂肪细胞.而Moerman等[11]研究发现随着间充质干细胞的老化，其分化成成骨细胞的能力减弱而分化成脂肪细胞的能力增强.另外，Chang等[12]同样认为 UCB－MSCs向脂肪方向的分化并不敏感.综上可以得出，相比BM－MSCs等成体来源的干细胞，UCB－MSCs更为原始、更为早期，其向脂肪细胞分化的可能性也相对降低.

当成骨诱导3周时，进行了von Kossa矿化结节染色，观察发现胞质内有钙化基质形成，同时被AgNO3染成了黑色，如图10所示.由于原代UCB－MSCs含量相对较少，发现微载体上黑色不是很明显，但同样可以确定为钙化基质.

图9 UCB－MSCs向成骨细胞分化的ALP染色Fig.9 ALP staining for osteogenic differentiation of UCB－MSCs

图10 UCB－MSCs向成骨分化的von Kossa染色Fig.10 von Kossa staining for osteogenic differentiation of UCB－MSCs

3 讨 论

本研究采用同一份脐带血来源的血清替代传统的胎牛血清，进行了UCB－MSCs和UCB－HSCs的共培养实验，结果从7份脐带血中成功培养出5份 UCB－MSCs，UCB－MSCs在cytodex－3微载体表面呈长梭样贴附，原代培养成功率达到71.4%，这与张勇刚[13]等的研究结果（71.2%）相近.

在96孔板的培养组中，考察了两种类型血清（人自体血清和胎牛血清）及其不同含量对原代UCB－MSCs在cytodex－3微载体表面贴附及生长情况的影响，同时用流式检测及细胞计数考察了同一体系下UCB－HSCs的扩增情况.结果表明，在96孔板培养体系中只添加血清的情况下，采用微载体技术可同时培养并收获同一份脐带血来源的UCB－HSCs和USB－MSCs，实验结果也表明传统的FBS可被从同一份脐带血中提取的HAS所代替，且低含量的HAS培养基可以达到高含量的FBS培养基的培养效果.分析实验数据得出，不同含量的血清对总有核细胞（NCs）的扩增倍数影响不是太大.另外，研究发现在 HAS组中11.1%的NCs扩增效果最好，在对照组FBS中10%含量的NCs扩增效果最好，但这两组间并无显著性差异（p＜0.05）.由流式检测得出，5.6%HAS对 UCB－HSCs的扩增效果最好，而10%FBS对UCB－HSCs的扩增最优.从CCK－8检测结果可以看出，贴附在微载体上的UCB－MSCs的扩增效果虽然都是随着两种血清含量的增加而略有提高，但各组间并没有显著性的差异，也就是说血清含量的影响并不是很大.所以，本文得出对于一次原代实验中同时培养UCB－HSCs和UCBMSCs而言，HAS的用量为5.6%时效果最佳.

对于所有的培养体系，从悬液中的总有核细胞（NCs）密度变化的情况可以看出NCs的扩增效果并不佳，经过4d的培养，11.1%HAS组的NCs仅扩增了（1.95±0.05）倍，而10%FBS组则扩增了（2.0±0.13）倍.可能的原因如下：① 细胞接种密度高：由于自脐带血分离获得的UCBMSCs的量较少，一般为（0.05～2.8）个/106单个核细胞[14].由于采用高密度接种有利于原代UCB－MSCs在微载体表面贴附及成功培养，本研究接种的细胞密度为2×106cells·mL－1.在此密度下，细胞已经很难扩增.先前的学者在造血干细胞的扩增中采用稀释换液，一般设定细胞的上限接种密度为1.5×106cells·mL－1[15].所以，只能采用相对较高的NCs接种密度才能在原代培养中同时获得UCB－MSCs和UCB－HSCs，则两种细胞在原代便难以获得好的扩增效果.但在以后的传代培养中可采用较低的接种密度及添加细胞生长因子等来获得高的扩增倍数.② 培养体系小：此次研究用的是96孔板的静态培养体系，只有100μL，容量过小，这同样是细胞扩增效果不佳的影响因素之一.另外，静态培养中营养物质分布不均、代谢产物无法及时排出等其他缺点也同样制约着培养效果.

尽管本研究中UCB－HSCs和NCs的同时扩增效果并不理想，很多方面工作也需进一步优化，但由实验可得出，采用同一份脐带血来源的血清对UCB－HSCs和UCB－MSCs的体外扩增有很好的支持作用，这样为干细胞在临床上使用的安全性提供了保障.在今后的研究中可考虑采用三维动态培养系统，如转瓶或旋转壁式生物反应器等，因为动态反应器不仅可以提供较大的培养空间来提高细胞的扩增能力，而且还可以使营养物质的供给更加充分，由此提高细胞的扩增能力.

4 结 论

离心后得到的脐带血来源的人自体血清可以代替传统的胎牛血清，可支持 UCB－HSCs和UCB－MSCs的体外培养，为这两种细胞提供营养成分.此外，HAS使得UCB－MSCs的原代培养成功率达到71.4%，同时支持其在微载体cytodex－3上的贴附、伸展与生长等特性.在只添加血清的96孔板培养体系中结合微载体技术可同时培养并收获同一份脐带血来源的UCB－HSCs和USBMSCs，且对于一次原代实验中同时培养UCBHSCs和 UCB－MSCs而言，HAS的用量约为5.6%时效果最佳.

[1] Bellantuono H.Hematopoietic stem cells [J].The International Journal of Biochemistry ＆ Cell Biology，2004，36（4）：607－620.

[2] SONG Ke－dong，ZHAO Guo－feng，LIU Tian－qing，etal.Effective expansion of umbilical cord blood hematopoietic stem/progenitor cells by regulation of microencapsulated osteoblasts under hypoxic condition[J].Biotechnology Letters，2009，31（7）：923－928.

[3] Mukhopadhyay A， Madhusudhan T， Kumar R.Hematopoietic stem cells：clinical requirements and developments in ex－vivo culture [J].Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，2004，86：215－253.

[4] Kim D H，Yoo K H，Yim Y S，etal.Cotransplanted bone marrow derived mesenchymal stem cells（MSC）enhanced engraftment of hematopoietic stem cells in a MSC－dose dependent manner in NOD/SCID mice[J].Journal of Korean Medical Science，2006，21（6）：1000－1004.

[5] McGuckin C P，Basford C，Hanger K，etal.Cord blood revelations—The importance of being a first born girl，big，on time and to a young mother！[J].Early Human Development，2007，83（12）：733－741.

[6] 范秀波，刘天庆，郝永杰，等.脐带血来源间充质干细胞体外分离培养条件的优化[J].生物化学与生物物理进展，2008，35（8）：905－913.FAN Xiu－bo，LIU Tian－qing，HAO Yong－jie，etal.Optimization for dissociation and culture of mesenchymal stem cells derived from umbilical cord blood[J].Progress in Biochemistry and Biophysics，2008，35（8）：905－913.（in Chinese）

[7] CHEN X，XU H， WAN C，etal.Bioreactor expansion of human adult bone marrow－derived mesenchymal stem cells [J].Stem Cells，2006，24（9）：2052－2059.

[8] SONG Ke－dong，LIU Tian－qing，CUI Zhan－feng，etal.3Dfabrication of engineered bone with human bio－derived bone scaffolds in a rotating wall vessel bioreactor [J].Journal of Biomedical Materials Research，2008，86A：323－332.

[9] SONG Ke－dong，YANG Zhi－ming，LIU Tian－qing，etal.Fabrication and detection of tissue engineering bones with bio－derived scaffolds in a rotating bioreactor [J]. Biotechnology and Applied Biochemistry，2006，45（2）：65－74.

[10] Kern S，Eichler H，Stoeve J，etal.Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow，umbilical cord blood，or adipose tissue[J].Stem Cells，2006，24（5）：1294－1301.

[11] Moerman E J，Teng K，Lipschitz D A，etal.Aging activates adipogenic and suppresses osteogenic programs in mesenchymal marrow stroma/stem cells：the role of PPAR－gamma2transcription factor and TGF－beta/BMP signaling pathways[J].Aging Cell，2004，3（6）：379－389.

[12] Chang Y J，Shih D T，Tseng C P，etal.Disparate mesenchyme－lineage tendencies in mesenchymal stem cells from human bone marrow and umbilical cord blood[J].Stem Cells，2006，24（3）：679－685.

[13] 张勇刚，王黎明，杨明理，等.自体血清培养人脐血间充质干细胞的实验研究[J].生物医学工程学杂志，2008，25（5）：1155－1160.ZHANG Yong－gang， WANG Li－ming， YANG Ming－li，etal.Experimental study on culture of human mesenchymal stem cells from cord blood using autologous serum [J].Journal of Biomedical Engineering，2008，25（5）：1155－1160.（in Chinese）

[14] 蔡琼霞，熊华锋，胡葵葵，等.脐血间充质干细胞分离培养的理论研究与应用[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11（28）：5630－5633.CAI Qiong－xia，XIONG Hua－feng，HU Kui－kui，etal.Theory and application of umbilical cord blood mesenchymal stem cell isolation and culture [J].Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research，2007，11（28）：5630－5633.（in Chinese）

[15] 刘 洋，刘天庆，范秀波，等.旋转壁式生物反应器中微囊化骨髓间充质干细胞支持造血干/祖细胞的体外扩增[J].高校化学工程学报，2008，22（3）：471－477.LIU Yang，LIU Tian－qing，FAN Xiu－bo，etal.Ex vivo expansion of cord blood hematopoietic stem/progenitor with support of microencapsulated mesenchymal stem cells in rotating wall vessel[J].Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities，2008，22（3）：471－477.（in Chinese）