白细胞介素1β通过β1整合素糖基化修饰诱导EA.hy926细胞凋亡

李佳佳，杨 竹，2，王应雄，于 超

(1.重庆医科大学生命科学研究院，重庆 400016;2.重庆医科大学第二附属医院妇产科，重庆 400010)

动脉粥样硬化形成的始动环节之一是血管内皮细胞功能损伤。而这种损伤又可能与高血压、糖尿病血管并发症等众多心脑血管疾病有着密切的联系［1－2］。IL-1β是白细胞介素1细胞因子家族的成员之一，是最重要的炎症细胞因子之一，它介导了炎症的重要过程，已有研究显示IL-1β可以导致血管内皮细胞功能紊乱［3－4］。认清这种细胞功能紊乱的机制，将会为动脉粥样硬化的形成机制提供较好的理论依据。

整合素(integrin)是一类重要的细胞表面受体家族，由α和β两个亚基组成，α和β亚基均由长的胞外区、跨膜区和短的胞内区组成，通过与细胞外基质，如纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白等黏附，在介导血管内皮细胞和肿瘤细胞的黏附、淋巴细胞运输、肿瘤生长及感染等方面发挥重要的作用［5－6］。有研究显示整合素β1与纤连蛋白(fibronectin，FN)结合，不仅调节细胞的黏附和迁移，而且调控细胞的分化与凋亡［7－8］。β1整合素的过表达可以抑制介导的生存信号，并能够抵抗顺铂诱导肝癌细胞凋亡，从而促进肝细胞肝癌的发展［9］。也有研究发现生长在有β1整合素的特异性配体FN上的卵巢癌细胞对顺铂诱导的细胞凋亡作用的敏感性下降［10］。以往的研究证实N-糖基化作用是整合素发挥作用必不可少的。本文旨在探讨β1整合素的N-糖基化作用与内皮细胞损伤之间的关系。

1 材料与方法

1.1材料RPMI 1640培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司;生长因子HAT购自Sigma公司;白细胞介素1β(IL-1β)购自 Prospec-Tany Technogene公司;蛋白裂解液及抗 β-actin，抗-Bcl-2，抗-Bax，抗-Caspase-3抗体购自 CST公司;抗 β1-integrin购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA，USA)公司。phytohemagglutinm lectin(L4-PHA)购自Vector lab公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及药物处理EA.hy926人脐静脉内皮细胞，以含10% 灭活胎牛血清、30 mg·L－1HAT生长因子添加物、1×105U·L－1青霉素、100 mg·L－1链霉素的 RPMI1640培养基，在 37℃、5%CO2条件下培养。0.125% 胰酶消化传代。待细胞生长到对数生长期后，取一定数量的细胞接种于培养板或培养瓶中，培养12 h后，改加含不同浓度的IL-1β(1、5、25 μg·L－1)的培养液处理24 h，空白对照组仅加入相同体积的培养液，进行相应细胞学检测。

1.2.2Western blot、Lectin blot、Immunoprecipitation分析收集前述处理后的细胞，加入CST裂解液(含10%Ser/Thr抑制剂，10%Tyr抑制剂，10%PMSF)裂解细胞，于12，000×g，4℃ 离心 15 min，收集上清液，加入5×蛋白质上样缓冲液，沸水中沸煮10 min。经 SDS-PAGE电泳，转移至 PVDF膜。用5% 脱脂奶粉封闭1 h，4℃过夜孵育一抗(Bcl-2、Bax、β1-integrin、Caspase-3、β-actin 抗体)或者凝集素L4-PHA，用TBST漂洗3次，再与相应辣根过氧化物酶偶联的二抗或卵白素室温孵育1 h。ECL化学发光法显影，在ChemDoc成像仪(Bio-Rad，USA)分析结果。对于免疫共沉淀实验，1.5 mg的全细胞蛋白裂解液与3 μl β1-integrin抗体共同4℃过夜孵育，再加入 20 μl Protein G beads 4℃孵育 120 min。孵育过后，用细胞裂解液洗3次。将上述处理过的裂解液重复Western blot步骤。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡收集一定数量细胞，加入5 μl标记有异硫氰酸荧光素(FITC)的膜联蛋白V(Annexin V)，再加入2 μl PI，充分混匀，避光37℃ 水浴温育15 min，最后加入400 μl缓冲液测定细胞凋亡。

1.2.4统计学方法每批试验至少重复3次，每组至少3个复孔，数据以±s表示，采用SPSS11.0软件分析，两组间差异用Student’st检验分析，多组间比较用方差分析法处理数据。

2 结果

2.1IL-1β诱导细胞凋亡为考察IL-1β对内皮细胞是否具有损伤作用，采用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果如Fig 1所示，空白对照组EA.hy926细胞的凋亡率为 0.84%，不同浓度 IL-1β(1、5、25 μg·L－1)处理 24 h后，则细胞凋亡率变为 1.35%、3.95%、6.81%(P＜0.05)。表明IL-1β可以抑制诱导细胞凋亡。

2.2白细胞介素1β抑制β1整合素的表达为了探讨IL-1β对于β1整合素及细胞凋亡的相关通路的影响，采用Western blot的方法对β1-integrin表达进行分析。结果如Fig 2所示，与对照组相比，当不同浓度 IL-1β(1、5、25 μg·L－1)处理24 h 后，β1-integrin明显降低(P＜0.05)。

2.3白细胞介素1β诱导细胞凋亡相关基因表达采用Western blot的方法对 Bcl-2、Bax和 Caspase-3表达进行分析。结果如Fig 3所示，细胞不同浓度IL-1β(1、5、25 μg·L－1)处理 24 h 后，与对照组相比Bax蛋白表达水平明显升高，Bcl-2的表达明显被抑制。而下游的细胞凋亡相关蛋白Caspase-3的表达水平也明显升高(P＜0.05)。结果提示，IL-1β可能通过膜上β1整合素的变化，进而调节线粒体膜上Bcl-2/Bax比值的改变，经一系列级联作用引起凋亡蛋白Caspase-3活性的改变，从而诱发细胞凋亡。

Fig 1 EA.hy926 cell apoptosis induced by IL-1β

Fig 2 Effects of IL-1β on β1-integrin in EA.hy926 cells

Fig 3 Effects of IL-1β on Bax，Bcl-2 and Caspase-3 in EA.hy926 cells

2.4IL-1β抑制EA.hy926细胞β1-6GlcNAc糖支链以及其所修饰的β1整合素的量为了验证IL-1β是否对细胞内β1-6GlcNAc糖支链有影响，采用Western blot及Lectin blot方法进行检测。如Fig 4所示，与对照组相比，当不同浓度 IL-1β(1、5、25 μg·L－1)处理24 h后，细胞内GnT-V及β1-6GlcNAc糖支链的量被抑制。为了考察β1-6GlcNAc糖支链的减少是否会影响其所修饰的β1整合素糖蛋白的量，采用免疫共沉淀实验进行检测。结果显示(Fig 3)，IL-1β(5 μg·L－1)处理24 h 后，与对照组相比，GnT-V所修饰的β1整合素的量明显下降。提示IL-1β诱导细胞凋亡可能是通过β1整合素的转录后修饰完成的。

3 讨论

血管内皮细胞(vascular endothelial cell，VEC)功能障碍是动脉粥样硬化形成的始动环节之一［11］。血管内皮不仅是IL-1β和众多炎症因子作用的重要靶细胞，也是一种效应细胞，因此，阐明IL-1β所致的内皮细胞损伤机制是非常有必要的。本实验首次证明了IL-1β可以减少GnT-V所修饰的整合素β1糖蛋白的量，从而促进凋亡因子的表达，提高细胞凋亡率。

近些年研究认为炎症因子，或者氧化应激与内皮细胞的凋亡密切相关。课题组证实H2O2可以诱导内皮细胞的凋亡［12］，同时也有文献发现TNF-α可以通过ERK通路介导内皮祖母细胞的凋亡［13］。本文通过流式细胞术证实IL-1β这种炎症因子也可以诱发内皮细胞凋亡。因此减少炎症因子对于内皮细胞的刺激对于动脉粥样硬化的预后起着关键的作用。

Fig 4 Effects of IL-1β on GnT-V(A)and β1-integrin protein β1-6GlcNAc modification(B)

近些年的研究发现β1整合素与细胞的凋亡密不可分［14］。β1整合素的过表达可以有效地抑制角膜细胞的凋亡，从而起到保护角膜损伤的作用［15］。有文献报道［16］，血管生成素-1通过β1整合素介导的Caspase-3降解起到保护心肌细胞的作用。同时也有学者发现IL-1β可以使软骨细胞中β1整合素减少，从而加重骨关节炎。为此，我们推断IL-1β是否可以同样抑制内皮细胞中β1整合素的表达，从而诱导内皮细胞凋亡。本文通过Western blot发现，随着IL-1β浓度增加，β1整合素的表达也随之下降。同时我们也证实，随着IL-1β浓度增加，Bcl-2/Bax的比例下降，Caspase-3活性增加。以往的对于β1整合素与凋亡的研究主要集中在其下游信号通路，比如ERK/MAPK信号通路等。β1整合素是一种糖蛋白，研究认为N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶V(GnT-V)可以调节细胞膜上β1整合素N-glycans的丰度，进而调节肿瘤细胞的转移和黏附等［17］。为此，我们就想了解在内皮细胞中IL-1β能否诱导β1整合素N-位糖基化的变化。在本文中，我们观察到IL-1β不仅能够影响N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶V及其产物的量，同时可以使整合素β1 N-位糖基化修饰量降低。这些结果提示我们β1整合素的转录后修饰可能影响到细胞的凋亡。IL-1β对功能蛋白N-位糖基化水平及其他信号传导通路的影响也有待深入研究。

包括内皮细胞在内的细胞凋亡是多因素多步骤的过程，寻找一个合适的治疗靶点是目前心血管疾病治疗的研究重点。本文对于跨膜蛋白β1整合素转录后修饰的研究将为日后治疗心血管疾病开辟新的靶点。

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