一种硬性接触镜护理液的安全性实验研究

金婉卿 翁郁华 陈云云 陈 浩

(温州医学院附属眼视光医院,浙江 温州 325027)

隐形眼镜又称接触镜,根据不同材料可分为软镜和硬镜。无论软镜还是硬镜,随着配戴时间的延长,镜片都容易附着沉淀物,这些沉淀物包括泪液中的蛋白质、脂类、色素、钙盐以及多种微生物等,沉淀物不仅降低了镜片的透光性、透气性,也容易引发眼内并发症,因此配戴接触镜的同时也需要对镜片进行合理的护理。本院研制出一种硬性接触镜护理液,成分主要包括三氟乙酸、消毒剂、pH调节剂等,综合了其他护理液的特点,能够清除硬性接触镜表面的蛋白沉积,保持镜片透光性。本文从刺激性、角膜细胞相容性等方面研究该护理液,从而为其安全性作出初步实验评价。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 新西兰大白兔6只,体质量2.5～3.0kg,雌雄各半,由丹阳市光明实验动物养殖场提供,合格证号:3200002369

1.1.2 试剂 硬性接触镜护理液(成分主要包括三氟乙酸、聚胺丙基双胍、缓冲剂等),由本院实验室2012年3月研制;丙酮,分析纯;生理盐水注射液(浙江康乐药业股份有限公司);WST-1细胞毒性测试试剂盒(碧云天生物技术研究所)、DMEM/F12、FBS、0.05%Trypsin-EDTA(gibco)。

1.2 实验方法

1.2.1 人眼角膜上皮细胞培养[1]所用细胞系为ATCC CRL-11135 HCE-2,培养基为含10%FBS、5μ g/mL 胰岛素 ,10ng/mL EGF,100μ g/mL 青 -链霉素的 DMEM/F12(1∶1)培养液,放于 37℃,5%CO2培养箱培养,待细胞生长至80%融合时以1∶4传代培养。

1.2.2 人眼角膜细胞相容性实验[1-2]HCE-2细胞在培养瓶中生长至80%融合后以0.05%Trypsin消化5分钟,调整细胞浓度为4×104个/mL接种于96孔板,设正常对照组、护理液组及空白对照组三个实验组,其中正常对照组、护理液组各加100μ L细胞液,空白对照组只加等量培养液,各组在培养箱中培养过夜,细胞贴壁后将原培养液吸出,正常对照组、空白组换为100μ L不含小牛血清的培养液继续培养、护理液组加等量护理液。每组设5平行组,6个时间点:15分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时,分别在培养特定时间后各孔加入10μ LWST-1试剂,细胞培养箱中孵育30分钟,用酶标仪检测各实验孔在450nm吸光度(opticaldensity,OD)值,按照如下公式计算护理液组细胞相对增殖率A=(护理液组吸光度值-空白组吸光度值)/(正常对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100%。

1.2.3 一次眼刺激实验[3-4]实验前24小时用2%荧光素钠染色、裂隙灯检查兔眼,选择无任何眼病变及炎症的健康新西兰白兔3只,左眼下结膜囊内滴入0.1mL硬镜护理液,被动闭眼2秒,此组作为护理液组,同法右眼滴入等量生理盐水,作为正常对照组。分别在滴眼后1、24、48、72小时使用裂隙灯检查兔眼结膜、虹膜、角膜等情况,根据表1眼损伤计分系统记分。

表1 眼损伤记分系统[5]

1.2.4 多次皮肤刺激实验[3]新西兰大白兔3只,实验前24小时将背脊两侧的毛用剃须刀剃去,约10cm×15cm大小区域。取2.5cm×2.5cm大小的两层纱布块若干,每块纱布块滴加0.5mL样品溶液浸湿,按照图1所示将纱布块贴敷于兔子裸露皮肤处,其中2、6处皮肤贴敷护理液(护理液组),3、5处皮肤贴敷生理盐水(正常对照组),纱布块上覆盖一层封口膜、两层干纱布,最后以医用透明敷料固定,敷用时间每天6小时,连续敷5天。每次贴敷结束后用温水除去受试物,自第5天除去受试物后1小时、24小时、48小时和72小时观察皮肤反应,按照2005版《医疗器械生物学评价》第10部分《刺激与迟发型超敏反应试验》皮肤反应记分系统记分[5],按照刺激反应类型评价刺激强度。

图1 兔子背部贴敷示意图

1.3 统计学处理 计量资料应用SPSS 19.0软件并采用t检验进行统计。

2 结 果

2.1 细胞相容性 空白对照组的设立是为了减去溶液及试剂本身的光吸收值,正常对照组与护理液组细胞同步培养,其中正常对照组细胞相对增殖率为1。护理液作用HCE-2细胞1小时,细胞相对增殖率均在80%以上,随后1～4小时细胞活性逐渐从80%降至20%以下,作用时间延长至24小时,细胞相对增殖率逐渐降低,大部分细胞形态都收缩变圆,但仍有1/10存活,详见图2。三组吸光光度值的原始数据详见表2。

图2 硬性接触镜护理液对HCE-2细胞增殖的影响

表2 不同实验组作用HCE-2细胞450nm吸光度值(OD)(,n=5)

表2 不同实验组作用HCE-2细胞450nm吸光度值(OD)(,n=5)

组 别 15 min 1 h 2 h 4 h 8 h 24 h空白对照组 0.203±0.004 0.198±0.005 0.194±0.000 0.198±0.001 0.201±0.003 0.157±0.001正常对照组 0.261±0.008 0.254±0.005 0.272±0.008 0.293±0.003 0.331±0.01 0.343±0.008护理液组 0.253±0.004 0.245±0.004 0.234±0.006 0.216±0.001 0.224±0.011 0.180±0.003

2.2 一次眼刺激实验[6-7]给药前以及给药后1、24、48、72小时用裂隙灯对兔眼进行检查,观察眼结膜、角膜、虹膜和其他损伤,将每一观察时间点每一动物的眼结膜、虹膜和结膜的刺激反应分值相加得总积分,将每组的总积分除以动物总数,即得刺激积分。给药后,与临床常用眼冲洗液生理盐水的正常对照组比较,两组在任何阶段均未出现眼睑水肿、分泌物增加等刺激性反应,眼部刺激积分均为0。

2.3 多次皮肤刺激实验[6-7]连续敷贴5次后,护理液组和正常对照组在敷贴期间兔子均无异常表现,给药后1小时两组皮肤出现极轻微红斑,随着观察时间的延长,红斑渐渐消失。护理液组与正常对照组治疗前评分均为0,敷贴后各时间点皮肤刺激评分均无显著性差异(均P＞0.05),详见图3、表3。

图3 兔皮肤刺激记分

表3 给药后多次皮肤刺激实验评分表(,分)

表3 给药后多次皮肤刺激实验评分表(,分)

组 别 n 1 h 24 h 48 h 72 h正常对照组 6 0.333±0.5160.333±0.5160.333±0.5160.167±0.408护理液组 6 0.500±0.5480.333±0.5160.333±0.5160.160±0.408

3 讨 论

与软镜一样,硬镜的护理也包括清洁、冲洗、消毒、贮存,目前相应的护理产品主要有多功能护理液(用于日常的护理步骤)和除蛋白液。关于这些护理产品的功效、和安全性等方面的研究较少。本院研制的一种硬性接触镜护理液,主要含三氟乙酸3g/L、聚胺丙基双胍1mg/mL、缓冲剂等,为一种无色无味的澄清液体。三氟乙酸为一种强酸,可用于清除蛋白沉淀,已有研究对其最佳的除蛋白浓度做了分析[8];聚胺丙基双胍为一种广谱、低毒、高效的表面活性剂,在硬性接触镜的护理中主要起到消毒杀菌作用[9];缓冲剂则可以调节溶液的pH值和渗透压,同时溶解其他成分,在接触镜护理中起到辅助作用。

在本护理液的细胞相容性实验研究中,为了分析该护理液在眼内直接滞留对人角膜上皮细胞的影响,作者设计了与正常生长不添加任何刺激物的对照组(细胞液+培养液)进行比较,结果发现该护理液(细胞液+护理液)作用于HCE-2细胞1小时以内,细胞的相对增殖率均在 80%以上;作用2小时,细胞也有＞50%的活性;作用时间越长越不利于细胞正常生长。钟兴武等[2]早期研究了4种隐形眼镜护理液,发现均存在对角膜上皮细胞明显的毒性作用,细胞暴露于护理液中2小时即能达到＞60%的毒性。这说明特殊作用的接触镜护理液对人眼角膜上皮细胞具有一定的毒性,时间越短毒性作用越弱。所以,具有去蛋白作用的硬镜护理液在使用时不允许直接接触人眼,硬镜经过护理液清除蛋白后要用基本无刺激的全功能护理液再进行冲洗和浸泡后才可以安全地佩戴入眼。该护理液也一样,其主要用途为去蛋白、清洁、消毒镜片,而不能直接接触角膜。

在眼刺激实验中,此硬性接触镜护理液与正常对照组(生理盐水)一样,对兔眼角膜、虹膜、结膜等在治疗后1、24、48、72小时刺激评分均为0,说明该护理液对眼无刺激性。在皮肤多次给药刺激实验中,敷贴后1、24、48、72小时各时间点皮肤刺激评分与正常对照组比较均无显著性差异(P＞0.05)。说明此护理液对兔皮肤无刺激性,属于皮肤非刺激物。所以,此护理液在动物眼表刺激和皮肤刺激方面均是安全的。

以上研究均停留在动物实验研究阶段,尚需结合目前临床上使用的进口硬镜去蛋白护理液进行深入地对照研究,以便为国产硬镜护理液的研究生产提供动物实验依据。

[1] Saarinen-Savolainen P,Jarvinen T,Araki-Sasaki K,et al.Evaluation of cytotoxicity of various ophthalmic drugs,eye drop excipients and cyclodextrins in an immortalized human corneal epithelial cell line.Pharmaceutical Research,1998,15(8):1275

[2] 钟兴武,龚向明,戴祖优,等.接触镜护理液对角膜上皮细胞毒性的研究.中国实用眼科杂志,1996,14(11):686

[3] 张笑乐,向楠,殷中琼,等.油樟叶挥发油对兔的急性皮肤刺激、眼睛刺激和皮肤光毒性的研究.中国农学通报,2011,27(23):36

[4] 董贤慧,钱涛,高维娟,等.纳他霉素滴眼剂对兔眼的刺激性研究.华西药学杂志,2011,26(1):34

[5] GB/T 16886.10.医疗器械生物学评价(S),北京:中国食品药品监督管理局,2005

[6] 陆龙喜,魏兰芬,傅桂明,等.全功能隐形眼镜护理液杀菌效果及毒性的研究.中国消毒学杂志,2005,22(1):30

[7] 魏兰芬,朱一凡,许天新,等.一种隐形眼镜护理液杀菌效果及毒性的研究.中国消毒学杂志,2003,20(1):27

[8] 章瑾,万子义,南开辉,等.硬性透气性角膜接触镜材料体外溶菌酶的短期吸附动力学.中国组织工程研究与临床康复,2010,14(3):473

[9] 林冬青.角膜接触镜的日常护理(上).中国眼镜科技杂志,2006,(9):113